Nanovesículas de tamaño controlado para aplicaciones biotecnológicas y bioanalíticas

Abstract

Las nanovesículas, un tipo particular de coloides orgánicos, está generando un interés creciente en el ámbito de la biotecnología, y particularmente en el campo del bioanálisis. La versatilidad de sus características morfológicas y funcionales hace de ellas un biomaterial muy interesante para vehículo de liberación de fármacos, marca de inmunoensayos, o como sistema biomiético de membranas o vesículas extracelulares. Sin embargo, estas nuevas aplicaciones imponen una serie de requisitos sobre los métodos de preparación que suponen un reto tecnológico y han generado un campo de investigación muy activo. El control sobre el tamaño de partícula y su monodispersidad son características esenciales que se deben controlar mediante la mejora de los métodos actuales y la propuesta de nuevas tecnologías diseñadas para tal fin. En este escenario científico-tecnológico se enmarca la presente Tesis Doctoral. El objetivo general es desarrollar métodos eficaces de síntesis con tamaño controlado. Con las vesículas obtenidas se han mimetizado exosomas (vesículas extracelulares) con el fin de investigar su uso como standard analítico en inmunoensayos. Estas vesículas están despertando un gran interés en el campo de la salud como nuevos biomarcadores, y son necesarias nuevas aproximaciones para poner a punto métodos de análisis. Tras una introducción sobre las generalidades de las nanovesículas, el quinto capítulo de la tesis presenta una profunda revisión del estado del arte del concepto de exosoma artificial, así como la revisión crítica de las diferentes aproximaciones metodológicas para su producción y una nueva clasificación de estos nuevos biomateriales en función de los mismos. Además, se han expuesto los usos biotecnológicos de dichas partículas, como son la distribución y liberación controlada de fármacos, su papel en diagnóstico, y su posible empleo en el desarrollo y estudio de métodos bioanalíticos. Para ello, es necesario procesos adaptados para la preparación de exosomas puramente artificiales mediante técnicas nano-biotecnológicas. Esta temática es precisamente sobre la que versa el trabajo experimental expuesto en los siguientes capítulos. El sexto capítulo presenta el desarrollo de un modelo matemático multivariante de Diseño de Experimentos y su aplicación al estudio de un método clásico de preparación de nanovesículas, como es la inyección de etanol. Con dicho estudio se pretende controlar los parámetros para la obtención de partículas con propiedades morfológicas deseadas y controladas. Para llevar a cabo el trabajo se han escogido dos formulaciones clásicas: una de liposoma y otra de niosoma. Además, se ha realizado un estudio de parámetros adicionales como la estabilidad coloidal y la eficacia de encapsulación de compuestos de diferente naturaleza química. En el séptimo capítulo se ha abordado la producción de niosomas de tamaño controlado y monodispersos mediante un dispositivo de microfluídica a temperatura controlada. El sistema ha sido diseñado para su acoplamiento sobre un microscopio invertido con el fin de observar los fenómenos de interfase acaecidos en su interior (como por ejemplo fenómenos de difusión molecular en flujo laminar). Además, se ha estudiado el efecto de parámetros metodológicos, poniendo especial énfasis en la temperatura. También se han tenido en cuenta otros parámetros como la longitud de la cadena hidrocarbonada del tensioactivo. Este sistema miniaturizado es idóneo para etapas de optimización de formulaciones y para la evaluación de la eficacia de encapsulación de las mismas, especialmente en los casos en que se disponga de poco volumen de reactivos. En el octavo capítulo se estudia la mejora de la encapsulación de compuestos hidrófilos mediante el empleo de disoluciones acuosas con poli-oles (glicerol y polietilenglicol), y el efecto de éstas sobre el tamaño de vesícula. Por otra parte, se evalúa el impacto sobre dichos parámetros que puede tener el peso molecular de los compuestos encapsulados. Este estudio se ha llevado a cabo con el empleo de una formulación basada en una mezcla de surfactantes no iónicos en presencia y ausencia de dodecanol como estabilizante de membrana. Finalmente, en el noveno capítulo se parte de los modelos obtenidos para niosomas en etapas anteriores, y han sido empleados para obtener partículas de tamaño y monodispersidad similar a exosomas naturales. Además, mediante la funcionalización superficial de los mismos con estreptavidina y posteriormente con péptidos biotinilados recombinantes de tetraspaninas (principal marcador molecular de exosomas), se han desarrollado exosomas artificiales. Dichos exosomas han sido testados mediante immunoensayos de tipo ELISA como un posible nuevo estándar analítico para el desarrollo y/o mejora de métodos bioanalítcos basados en el reconocimiento molecular para la determinación de vesículas extracelulares, como son los exosomas.