Identificación de nuevos biomarcadores de adaptación a estrés por altas temperaturas en pináceas mediante una aproximación de biología de sistemas

Abstract

El cambio climático y el calentamiento global se han agudizado en las últimas décadas, ejerciendo una enorme presión ambiental sobre los organismos vivos. Por lo que el actualcontexto de emergencia climática enfatiza la urgencia de descifrar y entender cómo las plantas perciben, responden, memorizan y se adaptan a eventos climáticos extremos como las olas de calor, que se encuentran entre los estreses más perjudiciales para las plantas y que además son extremadamente difíciles de controlar en condiciones de campo. A pesar de la relevancia de estos procesos de aclimatación y memoria, estos fenómenos están poco estudiados a nivel molecular, especialmente en especies no forestales modelo como Pinus radiata. Pinus radiata es una de las especies forestales más plantadas debido a su rápido crecimiento y calidad de la madera, además las poblaciones silvestres y manejadas de esta especie están distribuidas por todo el mundo. Teniendo esto en cuenta, el objetivo principal de esta tesis es identificar los mecanismos de adquisición de memoria y señalización de respuesta a alta temperatura más relevantes en dicha especie empleando un enfoque de proteómica subcelular y un sistema experimental realista acorde con el incremento de las temperaturas estimado para los próximos años para proporcionar un conjunto de indicadores robustos útiles para la selección temprana de árbolesy semillas termotolerantes. Para ello, en primer lugar, se llevo a cabo la optimización de un protocolo de extracción de núcleos y cloroplastos, y se desarrolló una nueva herramienta bioinformática (pRocessomics), que permitiría analizar de un modo más exhaustivo y reproducible los datos generados en esta Tesis. A continuación, para comprender mejor los mecanismos moleculares que conducen a la adquisición de la termotolerancia, así como a los procesos de establecimiento de la memoria, se simuló una ola de calor severa en condiciones controladas que permitió caracterizar los cambios que dan forma a la respuesta al estrés por calor. Estas alteraciones se monitorizaron a través de la determinación de biomarcadores fisiológicos, la cuantificación del proteoma subcelular de núcleos y cloroplastos, la inmunolocalización de metilación de citosina y los niveles de expresión génica de candidatos seleccionados, incluidos ARNm y microARN. La comparativa del proteoma del cloroplasto entre dos poblaciones isogénicas (silvestre y manejada) reveló una memoria heredada, y permitió distinguir diferentes estrategias de aclimatación, demostrando que las condiciones de crecimiento de las plantas parentales tienen un efecto de primado transgeneracional relacionado con alteraciones en el Fotosistema II y proteínas osmoprotectoras y que, además, esta memoria transgeneracional ayudó a superar el estrés aplicado. El análisis del proteoma nuclear (de la población no primada) durante el estrés y después de una fase de recuperación mostró el papel fundamental de los mecanismos epigenéticos (metilación del ADN, modificaciones de histonas y microARN) en la adquisición de la memoria (durante el estrés) así como en el mantenimiento de esta (después de la recuperación o fase latente). La inmunolocalización de 5 mC mostró una pérdida de metilación del ADN durante el estrés por alta temperatura, en paralelo con un descenso significativo en la abundancia de S-ADENOSILMETIONINA SINTASA (SAM), una proteína involucrada en el ciclo de metilación del ADN. Esta pérdida tanto en el nivel de metilación del ADN como en la abundancia de SAM se recuperó e incrementó su acumulación una vez las plantas estuvieron aclimatadas. Además, la histona H2A.X se identificó como variante termolábil e impulsora de la respuesta, lo que destaca el papel de la conformación de la cromatina durante el estrés y la recuperación. La integración de ambos subproteomas permitió obtener una comprensión más profunda de la comunicación nuclear y del cloroplasto para coordinar la respuesta de calor celular, mostrando la dinámica de la señalización anterógrada y retrógrada bajo condiciones de estrés, y cómo proteínas relacionadas con microARN como ARGONAUTA1, responsable del silenciamiento génico postranscripcional, parecen dirigir la aclimatación a altas temperaturas en esta especie. Finalmente, los niveles de expresión de los genes candidatos seleccionados se analizaron en semillas y plántulas (antes, durante y después de un tratamiento de estrés en los individuos primados y en los no primados). Esto permitió validar las hipótesis de los capítulos anteriores y diseñar un panel de biomarcadores de termotolerancia, donde miR160 y SAM parecen ser los candidatos más prometedores.