Desenvolupament d'una plataforma lab-on-a-chip per a la realització automatitzada d'assajos d'afinitat amb marca enzimàtica

Resumen

La necesidad de tener acceso a herramientas para diagnosticar una enfermedad rápidamente es cada vez más evidente, especialmente después de la pandemia provocada por el virus SARS-CoV-2. Actualmente la mayoría de análisis los hace personal técnico en laboratorios especializados, de forma que entre la toma de la muestra y la obtención de los resultados transcurren como mínimo 48h. Este retraso dificulta tomar decisiones y medidas con rapidez para actuar en consecuencia. Disponer de herramientas de análisis rápidas, robustas y que se puedan utilizar en el mismo lugar de atención al paciente (point-of-care) es una mejora considerable para el diagnóstico y seguimiento de una enfermedad. Algunas de estas herramientas ya están disponibles en el mercado, como el test de embarazo, el de detección de glucosa para diabéticos o el de SARS-CoV-2. Pero estos dispositivos solo permiten implementar protocolos de análisis simples que no requieran la manipulación de muchos reactivos ni consten de muchas etapas, o bien el resultado que se obtiene no es cuantitativo, lo que limita su uso para determinadas aplicaciones donde se requiere la cuantificación de la muestra. El desarrollo de dispositivos (lab-on-a-chip) que permitan suplir estas carencias, pasa por incluir otros elementos, como sistemas de detección más precisos o sistemas de bombeo de fluidos o de gestión de la circulación de múltiples reactivos (e.g. válvulas). Pero para integrarlos en plataformas que sean compactas y portables primero hay que miniaturizarlos, ya que la gran mayoría depende de elementos externos voluminosos que impiden su uso in-situ. Esta tesis parte de la tecnología de válvulas de cera integradas en dispositivos lab-on-a-chip desarrollada previamente en el Grup de Transductors Químics del Institut de Microelectrònica de Barcelona (IMB-CNM, CSIC). Estas válvulas se actuaban eléctricamente, pero se adaptó la actuación por pulsos de luz LED, ya que permitía simplificar la interfaz y desarrollar una plataforma potencialmente más compacta. La tesis se centra en adaptar la tecnología para integrar las válvulas en chips microfluídicos fabricados por técnicas de prototipado rápido. Aprovechando las ventajas que confieren estas válvulas, se ha desarrollado un instrumento portable para automatizar el funcionamiento de los chips que integra un sistema de bombeo y un sistema de medida de la absorbancia. Además, la plataforma se ha adaptado para desarrollar ensayos de afinidad con marcaje enzimático del tipo ELISA sándwich (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Para realizar estos ensayos se ha incorporado una fase sólida dentro del chip sobre la cual se han inmovilizado las moléculas de captura. Se ha evaluado el comportamiento fluídico de tres fases sólidas diferentes: microesferas de poliestireno, nitrocelulosa y vidrio. Se han puesto a punto un ensayo del tipo ELISA sándwich (sobre nitrocelulosa) y un ensayo del tipo ELONA (Enzyme-Linked Oligonucleotide Assay) (sobre vidrio). Los ensayos se han optimizado en chips sin válvulas y utilizando una bomba de jeringa comercial para garantizar un control ideal de los parámetros fluídicos. El primer ensayo se basa en la detección del factor de necrosis tumoral alpha (TNFα), una proteína pro-inflamatoria ampliamente usada como biomarcador para estudiar la respuesta antiinflamatoria frente a varias enfermedades. El segundo ensayo está pensado para detectar la secuencia de ARNr 16S de Escherichia coli mediante la interacción de esta con secuencias complementarias, en un formato de ensayo del tipo ELONA. E.coli es una de las bacterias más comunes causantes de infecciones, tanto en humanos como en animales. Por eso es un buen indicador de interés en ámbitos como la medicina, la industria alimentaria o el medio ambiente. Se ha demostrado la viabilidad de realizar inmunoensayos automatizados, aunque se han detectado necesidades de mejora del diseño que deberían solucionarse para poder explotar al máximo el potencial de la plataforma desarrollada.