Biomarcadores, a nivel de composición elemental e isotópica, de enfermedades oculares relacionadas con la edadestudios en fluidos biológicos y en células

Resumen

El ojo es un órgano altamente expuesto a procesos oxidativos e inflamatorios. En condiciones fisiológicas dispone de sistemas de defensa antioxidantes para contrarrestar el exceso de especies reactivas del oxígeno (ROS). Sin embargo, el desequilibrio a favor de las ROS desencadena en daño oxidativo, lo que a su vez se relaciona con la patogénesis de determinadas enfermedades oculares neurodegenerativas ligadas al envejecimiento, como la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) y el glaucoma. Adicionalmente, estos eventos producen una alteración del equilibrio homeostático del organismo, lo que se puede traducir en la liberación intracelular y citotóxica de metales esenciales tales como cobre y zinc durante el proceso degenerativo asociado al daño celular de estas patologías oculares. En este sentido y dado que la fisiología de estas patologías no se conoce en profundidad y su diagnóstico generalmente se produce en los estadios tardíos de la enfermedad, resulta evidente la necesidad de desarrollar metodologías analíticas enfocadas en una mayor comprensión de los procesos metabólicos implicados en estas enfermedades y/o la identificación de biomarcadores potenciales. En este contexto, el estudio de posibles alteraciones en la composición elemental de fluidos corporales y tejidos y su asociación con el desarrollo de enfermedades ha sido objeto de estudio durante años. Adicionalmente, se ha observado que el desarrollo y evolución de determinadas patologías también puede inducir cambios en la composición isotópica natural de determinados elementos como consecuencia del comportamiento ligeramente diferente de los isótopos de un mismo elemento en las reacciones (bio)químicas y/o los procesos físicos. En este sentido, el estudio del ionoma a nivel elemental e isotópico en fluidos biológicos, ya sea a nivel sistémico, o directamente relacionado con el órgano afectado, podrían contribuir a una mejor comprensión de la fisiología y fisiopatología del ojo. Debido a su alta sensibilidad, amplio rango dinámico lineal, capacidad para la determinación a nivel de trazas y ultratrazas, así como para medir relaciones isotópicas, la espectrometría de masas con fuente de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) es sin duda la principal técnica analítica empleada en el análisis de fluidos biológicos. Se ha de tener en cuenta que algunos fluidos biológicos pueden presentar una concentración de analito y/o volumen de muestra limitado. Sin embargo, el gran potencial que presenta el análisis de fluidos biológicos en la evaluación del estado de un individuo ha contribuido a que el análisis de micromuestras se haya convertido en una tendencia en la investigación actual, contribuyendo al desarrollo de metodologías analíticas complementarias a las herramientas comúnmente empleadas en el ámbito biomédico. En este contexto, el objetivo de la presente Tesis Doctoral ha consistido en investigar el potencial del análisis elemental e isotópico en fluidos biológicos y cultivos celulares con la finalidad de ahondar en el estudio de la dishomeostasis de metales desde una doble perspectiva: profundizar en el conocimiento de la implicación de estos metales durante el envejecimiento y consecuente desarrollo de enfermedades oculares neurodegenerativas, y la identificación de biomarcadores para su diagnóstico/pronóstico. Este objetivo general ha sido abordado a través de tres objetivos parciales. En el primer capítulo se evaluó la dishomeostasis de elementos que podrían estar implicados en la patogénesis de la DMAE. Si bien las alteraciones de la DMAE se limitan al sistema ocular, teniendo en cuenta que idealmente la toma de muestras biológicas debería ser lo menos invasiva posible, se planteó utilizar suero sanguíneo como muestra de estudio. Así, se determinaron Fe, Cu, Zn, P, Mg, Na y K en suero de pacientes diagnosticados con esta patología y se compararon los resultados obtenidos con una población control mediante el empleo de herramientas informáticas. Adicionalmente, se realizó el análisis isotópico de cobre, elemento involucrado en el ciclo visual, mediante ICP-MS de tipo multicolector (MC-ICP-MS). A raíz de los resultados obtenidos a nivel sistémico, en el segundo capítulo de la presente Tesis Doctoral, se decidió evaluar la variabilidad ionómica en un fluido biológico localizado y directamente relacionado con el órgano afectado. En concreto, se determinaron elementos químicos que podrían estar involucrados en la fisiología y patología del glaucoma en muestras de humor acuoso de pacientes con glaucoma pseudoexfoliativo (PEXG) y glaucoma primario de ángulo abierto (POAG). Adicionalmente, se llevó a cabo el análisis isotópico de cobre y zinc en este fluido biológico, lo que supuso un reto desde el punto de vista metodológico debido al limitado volumen de muestra. Por otro lado, y con el fin de evaluar la implicación del estrés oxidativo en el desarrollo de la enfermedad, se determinó la capacidad antioxidante total. El rol del zinc no solo se estudia en relación al desarrollo de determinadas patologías, sino que además es sabido que este metal ejerce un papel fundamental como regulador de la vía antioxidante y como agente antiinflamatorio. De hecho, la suplementación con zinc es comúnmente sugerida para reducir la progresión de la DMAE en las fases intermedia y tardía. En este contexto, en el tercer capítulo, se evaluó el papel protector del zinc en cultivos celulares del epitelio pigmentario de la retina (EPR) sometidos a eventos proinflamatorios (interleucina-1) desde una doble perspectiva: expresión génica y determinación y estudio de la composición isotópica de zinc.