New techniques for the fabrication of biosensors based on nad (P) + dependent dehydrogenases

Resumen

Antecedentes Un avance importante en el campo de química analítica se hizo por Clark y Lyons en los años setenta. Ellos propusieron acoplar la especificidad de la enzima glucosa oxidasa con la transducción electroquímica de la señal en biosensores. En general, los biosensores son artefactos integrados autocontenidos, capazes de proporcionar información analítica, cuantitativa utilizando un elemento biológico de reconocimiento (receptor bioquímico) que se retiene en contacto espacial directo con un elemento de transducción. Posteriormente, los primeros biosensores de glucosa, basados en la detección amperométrica de peróxido de hidrógeno generado por glucosa oxidasa en la presencia de oxígeno fueron introducidos en el mercado por la empresa estadounidense Yellow Spring Instrument Co. (Ohio, EE. UU.) en 1975. La respuesta de biosensores electroquímicos basados en el uso de oxígeno como cosustrato para oxidasas se ve desviada por la presencia de interferencias que pueden contribuir a la corriente. Por lo tanto la superficie de electrodo debe estar protegida por una membrana no permeable por sustancias que pueden interferir con la señal. Para evitar corrientes que perjudican la selectividad de los biosensores, el potencial aplicado puede ser aminorado usando electrocatalizadores difusionales (mediadores) en lugar de oxígeno, con un potencial redox controlable. Pero la respuesta de estos sensores también depende de la concentración de oxígeno porque este compite con los mediadores, para la reoxidación de las oxidasas. Un inconveniente adicional del uso de mediadores diffusionales artificiales en biosensores es la baja estabilidad de los mismos debida al escape de mediadores desde la superficie del electrodo cuando esto se usa en linea. Se puede aliviar este problema creando enlaces covalentes entre los mediadores y la superficie del electrodo o usando polímeros redox que se adsorben fucrtemente en la superficie del electrodo. Una de las posibles maneras para disminuir la influencia del oxígeno a la corriente de la respuesta de biosensores es el uso de las deshidrogenasas dependientes de la pareja redox NAD+/NADH. El potencial estándar redox de esta pareja es 0.56 V vs. SCE pero para conseguir la oxidación de NADH en la superficie de electrodos de carbono un sobrepotencial de +0.5 V vs. SCE debe aplicarse. Bajo estas condiciones los electrodos tienen tiempo de vida corto debido a la adsorción de los productos de oxidación en su superficie ya que la oxidación de NADH no es reversible químicamente. Por otro lado estos electrodos sufren por la oxidación no especifica de interferencias a estos potenciales de operación. Los electrodos modificados químicamente por mediadores pueden oxidar NADH a potenciales más bajos. Sin embargo, muchos de los mediadores mencionados en la bibliografía no son estables o/y no forman NAD+ enzimaticamente activo. Un problema adicional de los sistemas analíticos basados en deshidrogenasas dependientes de NAD+ es la necesidad de añadir este cofactór, que tiene alto coste y es inestable, en las muestras. Se puede inmovilizar NAD+ en la superficie de electrodos para producir biosensores capaces de funcionar en muestras que no contienen NAD+, biosensores reagentless (sin necesidad de adición de reactivos). Los métodos descritos en la bibliografía para la fabricación de biosensores reagentless se basan en cinco estrategias: (1) la inmovilización en hidrogeles formados in situ; (2) la inmovilización por una membrana; (3) la inmovilización en películas preparadas por electropolimerización; (4) la inmovilización en una pasta de carbono; (5) la inmovilización en monocapas auto ensambladas. Sólo los electrodos preparados con la estrategia (4) son biosensores reagentless con estabilidad operacional relativamente alta. Las demás estrategias no resultan en biosensores con suficiente estabilidad operacional por culpa de la perdida del mediador, de NAD+ o de la deshidrogenasa. Sin embargo la estrategia basada en electrodos de pasta de carbono no permite su aplicación a la producción de microsensores (electrodos con diámetro de menos de 10 ?m) para su uso in vivo. Metodología El objetivo principal de esta tesis es el desarrollo de nuevas estrategias para la fabricación de biosensores reagentless basados en deshidrogenasas dependientes de NAD+ con características mejoradas respecto a la densidad de la corriente, de la estabilidad operacional y de almacenamiento. Para cumplir el objetivo se han sintetizado dos nuevos mediadores para la oxidación de NADH: un polímero insoluble en agua [Os(1,10-fenantrolina-5,6-diona)2(PVP)4Cl]Cl, (Os-fendiona-PVP) y un complejo amfifílico [Os(1,10-fenantrolina-5,6-diona)24,4-(n-C18H37NHCO)2bpi)](PF6)2 (Os-fendiona-surfactante). El polímero Os-fendiona-PVP fue producido vía la derivatización de poli(vinilpiridina) (peso molecular 50000) con [Os(1,10-fenantrolina-5,6-diona)2Cl2]. El estudio electroquímico de este polímero redox adsorbido en electrodos de grafito se realizó por voltametría cíclica a distintas velocidades de barrido para evaluar el número de protones y electrones que participan en la reacción redox, la influencia del pH a su potencial estándar formal, y la constante de la transferencia heterogénea del electrónes kS. Bajo bien definidas condiciones hidrodinámicas se realizaron estudios para encontrar la constante de la interacción con NADH k[NADH]=0. Os-fendiona-surfactante fue producido por la complejacion de [Os(1,10-fenantrolina-5,6-diona)2]Cl2 con el ligando hidrófobo octadodecilamida del acido 2,2-Bipiridina-4,4-dicarboxilico. Las monocapas de Langmuir-Blorgett de Os-fendiona-surfactante y las de su análogo [Os(bpi)24,4-(n-C18H37NHCO)2bpi)](PF6)2 fueron estudiados en un equipo de Langmuir-Blodgett. Os-fendiona-surfactante fue aplicado a la construcción de biosensores reagentless del glutamato vía la inmovilización de glucosa deshidrogenasa y de NAD+ entre las bicapas en la fase lamelar formada por Os-fendiona-surfactante y el lípido 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfatidilcolina. Dos métodos adicionales para la fabricación de los biosensores reagentless de glutamato y glucosa basados en deshidrogenasas fueron desarrollados. Los electrodos del grafito fueron modificados con Os-fendiona-PVP y utilizados para (a) la inmovilización de deshidrogenasa y de NAD+ en un hidrogel formado por entercruzamiento de poli(vinilpiridina) modificado por grupos amino con el éter diglicidil de poli(etilenglicol); (b) la inmovilización por adsorción de la deshidrogenasa y del ácido algínico modificado por NAD+. Se ha hecho un estudio de los biosensores reagentless para calcular sus constantes de Michaelis, el efecto del pH y de la temperatura en su respuesta y su estabilidad operacional. Además se ha comparado la estabilidad operacional a temperaturas elevadas de biosensores de la configuración (a) usando glutamato, glucosa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasas termófilas y mesófilas. Por otro lado se han estudiado métodos nuevos para mejorar le estabilidad durante el almacenamiento de sensores de glutamato. Con este fin, se han preparado electrodos utilizando glutamato deshidrogenasa mesófila y termófila con varios estabilizadores. Conclusiones 1. El polímero [Os(1,10-fenantrolina-5,6-diona)2(PVP)4Cl]Cl, (Os-fendiona-PVP) para la oxidación de NADH se puede sintetizar por la complejación de [Os(1,10-fenantrolina-5,6-diona)2Cl2] con poli(vinilpiridina). La adsorción física de este polímero sobre los electrodos de grafito desde su solución en etilenglicol resulta en la formación de una monocapa de este polimero redox en la superficie del electrodo. 2. El proceso redox de este mediador es casi-reversible e implica 4 electrones y 4 protones dentro del rango del pH de 3-6.5. El mediador pierde su estabilidad química en valores de pH más altos que 6.5. Tres ramas lineales en el diagrama de E0 frente a pH con diversas pendientes se observan. 3. La constante heterogénea de la velocidad de transferencia de electrones (kS) de Os-fendiona-PVP es del mismo orden de magnitud que la de otros mediadores capaces de oxidar NADH mencionados en la bibliografía (kS= 18±2 s-1) . 4. Os-fendiona-PVP es un electrocatalizador eficiente para la oxidación del NADH. La modificación de los electrodos del grafito con Os-fendiona-PVP conduce a la disminución del sobrepotential para la oxidación electroquímica del NADH desde +0.33 V vs. Ag/AgCl/KClsat para los electrodos no modificados hasta +0.11 V vs. Ag/AgCl/KClsat. La constante cinética para la interacción del polímero redox con el NADH (k1,[NADH]=0 = (1.9±0.2)x103 s-1 M-1) coincide prácticamente con la de Os-fendiona que sugiere que el número de los ligandos de fendiona en los complejos del osmio es proporcional a la corriente de la respuesta al NADH pero no afecta a las constantes cinéticas electroquímicas.