Stability and folding of G-protein coupled receptors associated to degenerative diseases

Resumen

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) representan la mayor superfamilia de proteínas de membrana codificada por el genoma humano y también la mayor clase de dianas terapéuticas en diversas enfermedades. En esta tesis se estudian dos miembros de los GPCRs ; el pigmento visual rodopsina , asociado con la enfermedad degenerativa de la retina retinitis pigmentos a (RP) y el receptor de acetilcolina muscarínico 3 (M3R) asociado con la enfermedad de .AJzheimer (AD). La rodopsina es el fotorreceptor visual prototípico responsable de la visión escotópica y se encuentra distribuido por toda la retina . Después de la iluminación, el cromóforo 11-cis-retinal se isomeriza a todo-trans -retinal y desencadena una cascada de señales visuales . Mutaciones en rodopsina , tales como G90Vy N55K son causantes de RP. Para entender más profundamente los mecanismos moleculares causantes de esta disfunción visual debido a estas mutaciones , se han preparado membranas artificiales tales como bicelas de DMPC/DHPC y liposomas de DDHA-PC. Estos sistemas lipídicos ofrecen un entorno bicapa más nativo, comparado con el que proporciona el detergente dodecil maltosido (DM), usado más tradicionalmente, lo que preserva la estructura de la rodopsina nativa y de los mutantes y aumenta su estabilidad térmica. La regeneración de G90Vy N55K en bicelas de DMPC/DHPC es más elevada en comparación con el valor obtendio en detergente DM. La cinética de decaimiento de metarodopsina 11 (Meta 11) indica que la velocidad de liberación del retinal de los mutantes G90Vy N55K es más alta en presencia de las bicelas de DMPC/DHPC, y de los liposomas de DDHA-PC , en comparación con las velocidades obtenidas en DM. La adición del reactivo hidroxilamina después del decaimiento completo de Meta 11 de WT, y del mutante G90V, en las bicelas provoca un incremento de la intensidad de fluorescencia, indicando que parte de Meta 11 aún mantiene el retina! en el sitio de unión del ligando. Las bicelas de DMPC/DHPC y los liposomas de DDHA-PC también estabilizan la opsina del mutante G90V, obtenida después del decaimiento de la Meta 11, pudiendo ser regenerada a rodopsina después de añadir retina! exógeno. Por lo contrario, el mutante N55K no regeneró pudiéndose correlacionar este diferente comportamiento con los fenotipos clínicos específicos de cada mutante. Las interacciones entre la rodopsina y arres tina, y entre M3R y tau, se estudiaron para entender el mecanismo funcional de las enfermedades degenerativas de RP y AD respectivamente . La unión de rodopsina activa con el mutante de arrestina R175E, ralentiza la liberación de retinal desde el sitio de unión . Estudios futuros de esta interacción con mutantes asociados a RP ayudarán a explorar los mecanismos de terminación de señal visual, ysu conexión con las degeneraciones retinanas aspecto no muy estudiado hasta el momento. Por otro lado, la interacción de M3R WT, y los mutantes N132G y D518N, produce un cambio en la localización de tau desde el citoplasma a la membrana cuando se coexpresan en cèl·lules HEK293T. Además , los mutantes M3R 051 SK y K523Q también son afectados cuando se coexpresan pasando de la membrana al citoplasma. Estos cambios en las localizaciones celulares tanto de tau como del receptor son el resultado de las interacciones específicas entre ellos . Estos resultados proporcionan claves importantes sobre los sitios de unión de tau y M3R, así como la posible implicación de este complejo en la AD . En general, las membranas artificiales de DMPC/DHPC, y DDHA-PC, proporcionan un mejor entorno para estabilizar la rodopsina WT y los mutantes asociados a RP. Las diferentes propiedades obtenidas de los mutantes G90Vy N55K en estas membranas artificiales pueden estar asociadas a sus distintos fenotipos clínicos específicos. Por otra parte, los resultados obenidos en el estudio de las interacciones entre los GPCR y otras proteínas proporcionan una base adicional a los estudios asociados a enfermedades degenerativas.