Desarrollo de nuevas estrategias analíticas para la determinación de biomarcadores tumorales genómicos y proteicos mediante espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo

Resumen

El cáncer es un conjunto de enfermedades caracterizadas por el crecimiento anormal de las células de un tejido, que se multiplican sin control y se diseminan por todo el organismo, impidiendo su correcto funcionamiento. Este proceso se debe a la acumulación de cambios, genéticos y/o epigenéticos, que rompen el equilibrio entre la proliferación y la muerte celular. La mayoría de estos cambios provocan la aparición en el organismo de características detectables indicadoras del proceso tumoral, conocidas como biomarcadores, que juegan un papel muy importante para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento del cáncer. Sin embargo, su uso en clínica está supeditado a la disponibilidad de metodologías adecuadas para su determinación en muestras biológicas con exactitud y precisión. Por ello, el objetivo de la presente Tesis Doctoral fue la puesta a punto de nuevas estrategias analíticas basadas en el empleo de la técnica de espectrometría de masas con fuente de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) para la cuantificación en muestras biológicas de tres tipos de biomarcadores tumorales, las variaciones en el número de copias, CNVs, y los cambios en la expresión de ciertos genes; así como los niveles de la proteína HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2). En el primer capítulo, se desarrolló una metodología para la determinación de CNVs y de variaciones en la expresión génica de varios genes de forma simultánea, basada en la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con detección por electroforesis en gel (GE)-ICP-MS (monitorizando el fósforo). La metodología se aplicó a la cuantificación de CNVs y de expresión génica de genes relacionados con procesos tumorales en células de cáncer de ovario. Los resultados obtenidos con la metodología desarrollada son comparables a los obtenidos para cada uno de los genes en estudio de forma individual mediante la técnica de PCR cuantitativa, pero con la ventaja de que permiten estudiar varios genes de forma simultánea sin la necesidad de marcaje. En el segundo capítulo, se desarrolló una metodología para la determinación de HER2 en fluidos biológicos, que combina la especificidad de los inmunoensayos con la capacidad de amplificación de la PCR y la detección selectiva de fósforo mediante ICP-MS. La metodología desarrollada presenta una sensibilidad superior al de un ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) espectrofotométrico, y se puede aplicar para la determinación de HER2 en el sobrenadante del cultivo de células tumorales y en suero humano a concentraciones clínicamente relevantes (muy por debajo del nivel fisiológico de 2 ng/mL) con buena exactitud y precisión. En el tercer capítulo, se desarrolló una estrategia de análisis que permite estudiar los niveles de HER2, a nivel de célula individual, mediante el empleo de un anticuerpo específico contra HER2, marcado con un complejo del reactivo MAXPAR con el isotopo 175Lu, y el posterior análisis de las células individuales mediante single-cell-ICP-MS monitorizando el 175Lu+. La metodología desarrollada se aplicó al análisis de líneas celulares de cáncer de mama con distinto nivel de HER2. Además, se estudió su selectividad para estudiar, dentro de la misma población de células, dos proteínas diferentes presentes en la superficie celular (HER2 y el receptor de la transferrina 1) utilizando anticuerpos específicos para dichas proteínas marcados con distintos isótopos metálicos. Finalmente, se demostró la aplicabilidad de la metodología propuesta para distinguir células que expresan niveles elevados de HER2 de aquellas que tienen niveles constitutivos, dentro de una mezcla de ambos tipos de células. En comparación con un ensayo ELISA espectrofotométrico, la estrategia analítica propuesta proporciona información a nivel de célula individual de los niveles de HER2 presentes sólo en la superficie celular, que es la información clínicamente relevante.