Application of whole genome sequencing in the study of virulence factors, antibiotic resistance and epidemiology of respiratory pathogens

Resumen

Las enfermedades respiratorias siguen siendo una de las principales causas de mortalidad y morbilidad. Las bacterias que colonizan la nasofaringe pueden originar infecciones del tracto respiratorio y enfermedades graves como la bacteriemia o la meningitis. Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae son patógenos respiratorios cuya infección puede ser prevenida mediante vacunación. La introducción de vacunas ha modificado la epidemiología de estas poblaciones bacterianas haciendo necesarios estudios de vigilancia. Por otro lado, Haemophilus parainfluenzae se ha considerado tradicionalmente un patógeno oportunista, pero su papel como causante de infección está cada vez más reconocido. Aunque su frecuencia es inferior presenta mayores tasas de resistencia antibiótica. Estas tres bacterias comparten el mismo nicho ecológico, la nasofaringe, y son altamente capaces de intercambiar material genético. La recombinación favorece la adquisición de ADN homólogo o heterólogo presente en el ambiente, lo que resulta en genomas más complejos. La secuenciación de genoma completo (SGC) y su aplicación en la genómica bacteriana es una alternativa interesante que permite realizar un análisis en profundidad del genoma de estas bacterias. El objetivo de esta tesis es la aplicación de la secuenciación masiva en el estudio epidemiológico de factores de virulencia y resistencia antibiótica de estos tres patógenos respiratorios. En la primera parte de la tesis se ha analizado el impacto de la vacuna conjugada neumocócica trecevalente (VCN13) en la enfermedad neumocócica invasiva (ENI) en el adulto de seis hospitales de tres regiones de España. Se estudió la sensibilidad antibiótica, los serotipos y los genotipos en tres periodos; pre-VCN13 (2008-2009), VCN13 temprano (2012-2013) y VCN13 tardío (2015-2016). Los serotipos más frecuentes no incluidos en la vacuna en el periodo VCN13 tardío se secuenciaron para analizar el pangenoma. Además, se realizó un análisis en profundidad del serotipo 11A, principal causa de resistencia a β-lactámicos en el último periodo. Para analizar la diseminación en otros países del sudoeste europeo se solicitaron aislados del serotipo 11A resistentes a penicilina a los centros de referencia de Francia, Italia y Portugal, así como otras regiones de España. La segunda parte de esta tesis se ha centrado en el estudio de la estructura poblacional y el pangenoma de H. influenzae. Con esta finalidad, se secuenció una colección de 88 aislados invasivos de Portugal. El análisis reveló alta heterogeneidad genética en los aislados no tipables mientras que los aislados capsulares eran mayormente homogéneos. Estos resultados se corroboraron con el análisis de 37 H. influenzae serotipo f aislados en España, Portugal y Países Bajos. Tras la implementación de la vacuna conjugada contra el serotipo b a finales de los años ochenta el serotipo f es el serotipo capsulado más frecuente. Todos los aislados del serotipo f pertenecían al mismo clon previamente descrito y eran altamente homogéneos. En la última parte de esta tesis se estudió por SGC los mecanismos de resistencia de aislados multirresistentes (MDR) de H. parainfluenzae en una larga colección y se describió y visualizó, por primera vez, utilizando microscopia electrónica de transmisión, un operón capsular funcional en esta especie. Se evaluó la prevalencia de operones capsulares en nuestro hospital revelando su presencia en el 11.7% de aislados urogenitales y su ausencia en aislados respiratorios. Además, se examinaron los operones capsulares del género Haemophilus de genomas disponibles en el NCBI clasificándolos en tres grandes grupos en función de la región específica de cada serotipo.