Detección de cambios en la glicosilación de la psa asociados al cáncer de próstataselección de aptámeros y diseño de aptasensores electroquímicos

Resumen

El cáncer se asocia con procesos de glicosilación aberrante y en consecuencia cada tipo de cáncer se caracteriza por un cambio distintivo en la estructura de los glicanos enlazados a ciertas proteínas. Por lo tanto, el estudio de las alteraciones en las estructuras de glicanos asociadas al cáncer constituye una herramienta valiosa para el diagnóstico de este conjunto de enfermedades. En concreto, para el cáncer de próstata se han descrito variaciones en la estructura de los glicanos asociados al antígeno específico de la próstata (PSA por sus siglas en inglés), una glicoproteína biomarcadora de este cáncer. Más en detalle, se han descrito cambios en el contenido de ácidos siálicos y fucosa del núcleo en la estructura del glicano, y un aumento de las estructuras multiantenarias. Actualmente la cuantificación de un azúcar específico de una glicoproteína se lleva a cabo mediante ensayos que usan lectinas o derivados de ácido borónico para su reconocimiento. Estos receptores son genéricos para todas las glicoproteínas debido a que solamente tienen la capacidad de unirse a los azúcares. Por este motivo estos se utilizan en combinación con un receptor específico (anticuerpo o aptámero) de la proteína de interés, para discriminar entre glicoproteínas que poseen los mismos azúcares en su estructura glucídica. Por lo tanto, hay una clara necesidad de disponer de nuevos receptores para las glicoproteínas que incorporen en el reconocimiento tanto a los azúcares como a su región peptídica (reconocimiento binario). Debido a su naturaleza, los aptámeros podrían ser un buen receptor para lograr este reconocimiento binario de las glicoproteínas. En la presente Tesis Doctoral se ha diseñado dos metodologías SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) distintas para dirigir la selección de aptámeros hacia el sitio de glicosilación de la PSA. El primer SELEX se basa en la incorporación de etapas de contra-selección frente a una forma recombinante de la PSA, que carece de la estructura de glicanos. Así se eliminan de la colección de secuencias de ADN aquellas que se unen a la parte peptídica de la proteína. Tras seis rondas de selección, de las cuales dos fueron contra-selecciones, se identificaron los aptámeros de la última ronda mediante secuenciación masiva y se clasificaron en familias empleando herramientas bioinformáticas. Los aptámeros seleccionados de cada familia se caracterizaron mediante ensayos de unión con detección electroquímica y medidas de SPR para evaluar su afinidad por la PSA y la capacidad de reconocimiento de los glicanos. Uno de los aptámeros seleccionados, el PSA-1, es capaz de reconocer los glicanos pero no tiene selectividad frente a otras glicoproteínas con una estructura de glicanos similar. En el segundo SELEX se intentó mejorar el proceso de selección para obtener un receptor con la capacidad de reconocimiento binario. Este se basa en la incorporación de etapas de contra-selección frente a la PSA recombinante y la elución competitiva de las secuencias que se hayan unido a la PSA con la lectina PhoSL. Los aptámeros que sobrevivieron hasta la última ronda de selección se clonaron, secuenciaron y se clasificaron en familias con programas bioinformáticos. Los aptámeros seleccionados se caracterizaron con ensayos de unión con detección electroquímica, obteniéndose uno (PSAG-1) capaz de reconocer específicamente los glicanos de la PSA debido a que interacciona no solo con la estructura de azúcar sino también con aminoácidos del entorno del sitio de glicosilación. Se estudiaron los complejos aptámero-proteína mediante ensayos empíricos y modelización computacional para conocer los azúcares que están involucrados en el reconocimiento. Con ambas metodologías se observa que el aptámero PSA-1 reconoce a los azúcares más externos del glicano (ácido siálico y galactosa) y que no reconoce la zona peptídica. Por el contrario, el aptámero PSAG-1 reconoce los azúcares más internos de la estructura, incluida la fucosa del núcleo, y algunos aminoácidos de la PSA. Los aptámeros seleccionados y uno ya descrito previamente para la PSA (anti-PSA), que reconoce solo a la PSA por la parte peptídica, se emplearon para la construcción de aptasensores electroquímicos basados en formato tipo sándwich o directos sin el empleo de marcas, y en ambos casos se utilizaron electrodos de oro como transductor. Ambos aptasensores responden a diferentes concentraciones de PSA en suero humano y se aplicaron al análisis de muestras de suero de pacientes con patologías benignas o malignas de próstata o con patologías no relacionadas con la próstata. El sensor basado en un formato tipo sándwich, en el que se emplean los aptámeros PSA-1 y anti-PSA, tiene un límite de detección de 0.66 ng/mL y un intervalo de trabajo entre 0.66 ng/mL y 25 ng/mL en suero con una mínima dilución, cubriendo el intervalo de concentraciones con relevancia clínica para el diagnóstico del cáncer de próstata. Además, el sensor desarrollado posee una excelente selectividad frente a otras glicoproteínas y componentes de la sangre. En el análisis de suero de pacientes mostró una mejor capacidad de discriminación entre pacientes con cáncer de próstata e hiperplasia benigna de la próstata que el test ELISA que se emplea como referencia. El sensor con un formato directo es una plataforma dual impedimétrica en la que se emplean los aptámeros PSAG-1 y anti-PSA para la cuantificación en suero de la PSA con un determinado patrón de glicosilación y de la PSA total, respectivamente. Estos sensores tienen un intervalo de trabajo entre 0.26 y 62.5 ng/mL para el sistema basado en el aptámero PSAG-1, y entre 0.64 y 62.5 ng/mL para el basado en anti-PSA. Empleando esta plataforma sensora se obtuvo un índice empírico, que se denominó “Glycan Score”, que mide la relación entre la cantidad de PSA reactiva al aptámero PSAG-1 y la PSA total. La correlación entre el valor del Glycan Score y el diagnóstico permite diferenciar claramente entre pacientes con cáncer de próstata de aquellos pacientes sanos o con una patología benigna de la próstata. Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral muestran que la detección de los glicanos asociados a PSA empleando aptámeros es una buena alternativa para la detección del cáncer de próstata, con potencial para mejorar los resultados clínicos del test ELISA para PSA actualmente en uso en los laboratorios clínicos. La traslación de este tipo de ensayos a la clínica podría reducir el número de biopsias de próstata innecesarias para el diagnóstico de cáncer de próstata.