Apogamy in the fern dryopteris affinis ssp. Affinis. Physiological and transcriptomic approach

Resumen

Esta memoria de tesis aborda un estudio sobre el desarrollo vegetativo y reproductivo del gametofito helecho Dryopteris affinis ssp. affinis, cuyo ciclo vital cuenta con un caso peculiar de apomixis. En concreto, se informa de un enfoque fisiológico y transcriptómico, revelando un papel de las fitohormonas, ya sea mediante el análisis de los efectos causados por la adición al medio de cultivo, o midiendo los niveles endógenos, así como a través de perfiles transcriptómicos comparativos entre gametofitos unidimensionales y bidimensionales. La tesis consta de cinco capítulos: una introducción, tres trabajos experimentales y una discusión general. En la introducción, se ofrece una visión general de la investigación llevada a cabo en helechos en los últimos años, para que el lector conciba una nueva idea sobre la contribución que este grupo vegetal puede ofrecer para profundizar en la reproducción de plantas, y en el concreto, en la apomixis. En cuanto a los capítulos experimentales, el primero de ellos, hace referencia a los efectos que tiene la adición al medio de cultivo del gametofito, de una selección de fitohormonas e inhibidores de biosíntesis y transporte, reflejando una modulación del desarrollo por parte de auxinas, giberelinas y poliaminas. Además, se ofrece un protocolo válido para inducir y proliferar tejido de callo. En el segundo capítulo, se analizan los niveles endógenos de auxinas, citoquinas, ácido abscísico, giberelinas, ácido salicílico y los brasinosteroides, por cromatografía líquida-espectrometría de masas de ultra-rendimiento (UHPLC), en gametofitos apogámicos en tres estados de desarrollo (filamentosos, espátulas y corazón), y en gametofitos acorazonados femeninos, de su progenitor sexual D. oreades, revelando variaciones en el contenido. Finalmente, en el tercer capítulo experimental, se generó un transcriptoma de novo y utilizando un enfoque RNA-seq, se compararon los perfiles de expresión génica de gametofitos unidimensionales y bidimensionales. Genes implicados en la regulación del desarrollo del meristemo, señalización de auxinas, reproducción y metabolismo de la sacarosa se regularon al alza en gametofitos bidimensionales, y genes implicados en respuesta a estímulo y defensa, así como en regulación epigenético y degradación de la ubiquitina, sobreexpresaban en gametofitos unidimensionales. Los resultados obtenidos proporcionan nueva información sobre la reproducción vegetativa y apogámica en el gametofito de vida libre, y representan un recurso útil para nuevas investigaciones en plantas no modelo. RESUMEN (en Inglés) This work represents a step forward to gain a better knowledge on the apogamous process in the fern Dryopteris affinis ssp. affinis, which represents a peculiar case of apomixis, in ferns. In concrete, a physiological and transcriptomic approach are reported, revealing a role of phytohormones, either by analyze the effects caused by the addition to the culture medium, or by measuring their endogenous levels, as well as through comparative transcriptomic profiles between of one- and two-dimensional gametophytes. The thesis comprises five chapters: an introduction, three experimental works, and a general discussion. In the introduction, a general view on the research driven on ferns for the last years is provided, so that the reader could conceive a new idea about the contribution this plant group might offer to deepen on plant reproduction, and in concrete on apogamy. Regarding the experimental chapters, the first one dealt with the effects caused by a wide sort of the major group of phytohormones and inhibitors of their biosynthesis and transport, reflecting a modulation of the vegetative and apogamous development by auxins, gibberellins and polyamines. Additionally, a valid protocol is available to induce proliferating callus when cultured in presence of 2,4D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), showing bodies of lipid accumulation is reported. In the second chapter, the endogenous levels of auxins, cytokinins, abscisic acid, gibberellins, salicylic acid and brassinosteroids were assessed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC) in filamentous, spatula and heart-shaped gametophytes of the apogamous fern Dryopteris affinis ssp. affinis, and in female heart-shaped gametophytes of its sexual progenitor D. oreades, revealing different profiles comparing intra an inter species. In the third experimental chapter, a gametophyte de novo transcriptome using an RNA-Seq approach was done and used to compare the gene expression profiles of one- and two-dimensional gametophytes. Genes implicated in the regulation of meristem growth, auxin signaling, reproduction, and sucrose metabolism were upregulated in two-dimensional gametophytes, and genes enriched in stimulus and defense genes as well as genes involved in epigenetic gene regulation and ubiquitin degradation, in one-dimensional gametophytes. Our results provide insights into the vegetative and apogamic reproduction in the free-living gametophyte, providing a useful resource for further investigations of asexual reproduction in non-model plants.