Metabolismo de isoflavonas y formación de equol por bacterias del tracto gastrointestinal humano

Resumen

Las isoflavonas y sus metabolitos se asocian con diversos efectos beneficiosos para la salud humana. Tras su ingesta, se metabolizan por la acción de enzimas celulares y otros de la microbiota intestinal que las convierten en compuestos más biodisponibles, inactivos o más activos, como el equol a partir de la daidzeína. El equol es el metabolito de las isoflavonas con mayor poder estrogénico y capacidad antioxidante. Su biosíntesis tiene lugar por la acción secuencial de tres reductasas bacterianas. Sin embargo, el fenotipo productor de equol está presente solo en un 25-50% de la población. Los sujetos productores de equol pudieran ser los que más se benefician del consumo de isoflavonas. En la actualidad, no se sabe con exactitud qué componentes de la microbiota son responsables de la producción de equol, ni qué factores favorecen su desarrollo o actividad. En los microorganismos implicados, además, las rutas metabólicas, los enzimas responsables y los mecanismos de regulación son poco conocidos. Este conocimiento es esencial para extender los beneficios del consumo de isoflavonas a la población general con independencia de los taxones presentes en sus intestinos. En este contexto, en esta Tesis Doctoral se plantearon los siguientes objetivos: (i) desarrollar métodos para la detección y cuantificación de las poblaciones involucradas en el metabolismo de las isoflavonas y en la producción de equol, (ii) estudiar la interacción entre isoflavonas y poblaciones microbianas intestinales con especial interés en las que intervienen en la formación de equol y (iii) caracterizar la producción de equol en muestras fecales y en bacterias productoras con el fin de maximizar la formación endógena y su producción biotecnológica. Para la detección y monitorización de genes involucrados en la síntesis de equol y los microorganismos responsables, se desarrollaron y aplicaron técnicas de qPCR y metagenómica no dirigida (shotgun). El método de qPCR permitió la monitorización de los genes de producción de equol, y en consecuencia las bacterias que los portan, en muestras fecales de mujeres productoras y no productoras. En este sentido, la secuenciación shotgun detectó unas pocas secuencias de taxones productores de equol, aunque la cantidad resultó similar en muestras de mujeres productoras y no productoras. La profundidad de secuenciación alcanzada, sin embargo, no permitió detectar genes involucrados en la síntesis de equol. El estudio de las interacciones isoflavonas-microbiota mostró que, aunque sin apenas efecto antimicrobiano, las isoflavonas parecen ser capaces de modular el desarrollo de diversas poblaciones intestinales, favoreciendo o inhibiendo su crecimiento de forma selectiva. Mediante el cultivo de aislados intestinales en medios con isoflavonas, se identificaron biotipos capaces de transformar las isoflavonas en compuestos derivados. Sin embargo, no identificamos bacterias capaces de producir equol, ni siquiera a pesar de que una de las cepas pertenecía a la especie productora Adlercreutzia equolifaciens. La secuenciación y análisis del genoma de esta cepa (IPLA 37004), y su comparación con el genoma de la cepa tipo (DSM19450T), reveló la deleción completa en la primera del clúster de síntesis de equol. La comparación genómica de esta y otras cepas de especies emparentadas mostró que la deleción de los genes de producción de equol está muy extendida, lo que sugiere que, en la actualidad, en el intestino humano el fenotipo productor no ofrece a las bacterias una ventaja selectiva. El tercer objetivo se abordó en tres trabajos independientes. Mediante la utilización de un modelo de intestino artificial, demostramos que una dieta rica en carbohidratos es capaz de duplicar la producción endógena de equol, sin incrementar, aparentemente, las poblaciones productoras. En el segundo, se estudió la transcripción de los genes del clúster de equol en A. equolifaciens DSM19450T. Este análisis reveló la presencia de un operón constituido por 13 genes contiguos que incrementan su expresión en presencia de daidzeína. En un artículo final, se sintetizó una secuencia de ADN con cuatro genes basada en el operón de esta cepa y se clonó en Escherichia coli y en Lactobacillus casei. Las cepas recombinantes de E. coli produjeron equol a partir de daidzeína mientras que los transformantes de L. casei solo produjeron equol con dihidrodaidzeína como sustrato. Aunque son necesarios más estudios, los resultados de esta Tesis contribuyen a desentrañar las complejas relaciones isoflavonas-microbiota y sientan las bases para profundizar en mejorar la producción endógena y heteróloga de equol.