Role of kv1.3 channels in the phenotypic switch of human vascular smooth muscle cells

Resumen

INTRODUCCIÓN La pared de los vasos sanguíneos está compuesta en parte por células de músculo liso (VSMC) cuya contracción permite que el vaso aumente o disminuya su calibre para ajustar el flujo sanguíneo a las necesidades de los tejidos en cada momento. Por ello se dice que estas células presenta un fenotipo contráctil. Para realizar su función, la VSMC cuenta con multitud de canales iónicos en la membrana plasmática que establecen el potencial de membrana y controlan la concentración de determinados iones dentro de la célula. A diferencia de otras células adultas terminalmente diferenciadas, la VSMC presenta una gran plasticidad y, en respuesta a diferentes estímulos (como un daño en la pared del vaso), es capaz de desdiferenciarse hacia un fenotipo que prolifera, migra y sintetiza componentes de la matriz extracelular (fenotipo proliferativo). Está bien documentado el cambio en la expresión de algunos canales iónicos que acompaña a este proceso de modulación fenotípica. Así, en un estudio previo (Cidad et al., 2010) pudimos observar cambios en la expresión de los canales de potasio dependientes de voltaje Kv1.3 y Kv1.5 que ocurren en VSMCs de ratón. Debido a los efectos opuestos de cada canal en relación a la proliferación, el cociente entre ambas expresiones constituye un parámetro con el que poder indicar el fenotipo que presenta la célula. Un trabajo posterior (Cidad et al., 2012) usando células HEK293 transfectadas con mutantes de Kv1.3 impermeables a potasio reveló que, a diferencia de otros canales iónicos, Kv1.3 no estimula la proliferación indirectamente, actuando sobre el potencial de membrana. Más bien detecta cambios en el potencial de membrana, que convierte en señales proliferativas, mediante un mecanismo desconocido. OBJETIVOS En el estudio que nos concierne, exploramos si este cambio en el ratio Kv1.3/Kv1.5 durante la modulación fenotípica se conserva en humanos, así como las vías de señalización intracelulares implicadas. MATERIAL Y MÉTODOS Para realizar este trabajo tuvimos acceso a muestras de arteria coronaria, renal y uterina así como vena safena a través de la Colección de Muestras Arteriales Humanas de la Red de Investigación Cardiovascular Heracles (COLMAH-HERACLES). Estas muestras se usaron bien directamente (VSMCs contráctiles) o bien se sembraron para obtener VSMCs en cultivo (VSMCs proliferativas). Los niveles de expresión de Kv1.3 y Kv1.5 se determinaron por PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR), mientras que los niveles de expresión proteica se analizaron mediante la técnica de Western-blot. La caracterización funcional de estos canales se llevó a cabo mediante experimentos de patch-clamp en la conformación de whole-cell, usando bloqueantes selectivos de canales de potasio. Finalmente, los estudios de proliferación de las VSMCs se realizaron mediante ensayos de incorporación de un análogo de la timidina (EdU). RESULTADOS Los primeros resultados revelaron que los transcritos de Kv1.5 son más abundantes en las células contráctiles, mientras que Kv1.3 predomina en las células proliferativas. Esto se debe a que Kv1.5 desaparece prácticamente en el fenotipo proliferativo, al tiempo que la expresión de Kv1.3 varía muy poco. Además constatamos que este cambio en el ratio Kv1.3/Kv.15 en respuesta a factores mitóticos ocurre mucho antes de que observemos células proliferando y migrando fuera de los explantes. A modo de referencia comprobamos los cambios en el canal de potasio activado por calcio de conductancia intermedia, IK1 cuya expresión se sabe que varía en ambos fenotipos. A diferencia de este, Kv1.3 no modifica su expresión en respuesta a mitógenos, sin embargo cuando bloqueamos selectivamente cualquiera de estos canales, aumenta la expresión del canal correspondiente. Esto nos sugiere que la presencia de ambos canales en membrana es necesaria para la proliferación, siendo Kv1.3 más bien un prerrequisito mientras que IK1 es una consecuencia de esta. Los ensayos de Western-blot junto con los experimentos de patch-clamp usando bloqueantes específicos para el Kv1.3 (PAP-1 100 nM y margatoxina 10 nM) y Kv1.5 (DPO 100 nM) constataron el mayor peso de Kv1.3 en el fenotipo proliferativo y de Kv1.5 en el contráctil. Además, PAP-1 y margatoxina disminuyeron la proliferación de las VSMCs inducida por PDGF-BB. Con el objetivo de explorar los mecanismos moleculares implicados en el papel del Kv1.3 en la proliferación, usamos como estímulo mitótico PDGF-BB y bloqueamos selectivamente las diferentes cascadas de señalización desencadenadas por la unión de este a su receptor. Los inhibidores de ERK1/2 y de PI3K disminuyeron la proliferación mediada por PDGF-BB. Cuando estos mismos ensayos se realizaron en presencia de PAP-1, la inhibición de la vía de ERK1/2 no se alteró, sugiriendo que Kv1.3 estimula la proliferación a través de esta vía. Por otra parte, la inhibición de la proliferación inducida por el bloqueo de PI3K y mTOR incrementó con el bloqueo de Kv1.3. Este efecto aditivo del bloqueo de Kv1.3 sobre el bloqueo de mTOR se caracterizó a distintas concentraciones del bloqueante de mTOR everolimus, observando que se mantenía constante a todas las concentraciones probadas. CONCLUSIONES A la luz de estos resultados, podemos enunciar las siguientes conclusiones: 1. El remodelado fenotípico de las VSMCs humanas se asocia con un cambio en la expresión de Kv1.3 y Kv1.5, en todos los lechos vasculares estudiados (RA, CA, UA y SV). En estos lechos, el Kv1.5 es, de los Kv1 el tránscrito que más se expresa en el fenotipo contráctil, mientras que el Kv1.3 es el predominante en el fenotipo proliferativo. 2. Estos cambios en la expression de Kv1.3 y Kv1.5 se pueden expresar mediante el ratio Kv1.3/Kv1.5, que aumenta muy destacablemente con la proliferación. Cuando lo expresamos en una escala logarítmica, dicho ratio varía de valores negativos en el fenipico contractile (Kv1.5 se expresa más que Kv1.3) a valores positivos en el fenotipo proliferativo (Kv1.3 se expressa de 10 a 10.000 veces más que Kv1.5). 3. Los cambios en el ratio Kv1.3/Kv1.5 son un evento temprano durante el proceso de la desdiferenciación de la VSMC, ya que pueden detectarse antes de que se aprecie una proliferación en respuesta al PDGF-BB. Esta observación sugiere que los cambios en los niveles de expresión de los canales Kv durante el remodelado fenotípico, podrían representar un evento relevante para facilitar la proliferación celular. 4. Los niveles de expresión del Kv1.3 no varían significativamente cuando las VSMCs se estimulan con suero o PDGF, en comparación con las VSMCs contráctiles o cultivadas en 0% suero. Indicando que la expresión del canal Kv1.3 es constitutiva y no está regulada por mitógenos. 5. El bloqueo selectivo del Kv1.3 inhibe la proliferación inducida por PDGF-BB en todas las VSMCs estudiadas, de forma similar, pese a las diferencias en la expresión de los canales de K+ entre los distintos lechos. 6. El bloqueo de los canales Kv1.3 inhibe la proliferación de las VSMCs no solo en respuesta a PDGF, sino también en respuesta a suero y ATII, indicando que el papel del Kv1.3 en la proliferación de las VSMCs no depende de mitógenos. 7. Además, observamos un efecto anti-proliferativo con los bloqueantes del IK1. Este efecto no fue aditivo al efecto de los bloqueantes de Kv1.3, sugiriendo que ambos canales (IK1 y Kv1.3) estimulan la proliferación mediante una vía de señalización común. 8. La proliferación de las VSMCs coronarias inducida por PDGF implica la activación de las rutas de ERK, PLC¿ y PI3K, pero no las rutas de p38 ni la kinasa de Jun. 9. Los efectos de los bloqueantes de Kv1.3 sobre la proliferación inducida por PDGF se ocluyeron en presencia de los bloqueantes de PLC¿ y ERK, indicando que Kv1.3 induce proliferación actuando a través de ambas vías. Por el contrario, los bloqueantes de Kv1.3 tuvieron un efecto aditivo a los bloqueantes de de la vía de la PI3K a la hora de reducir la proliferación. Esto implica que la proliferación inducida por Kv1.3 no está mediada por la activación de la cascada de la PI3K. 10. Hemos demostrado y caracterizado un efecto aditivo e independiente de los bloqueantes de Kv1.3 y mTOR en la inhibición de la proliferación de las VSMCs coronarias. Los resultados aquí presentados abren nuevas vías para la mejora de las terapias actuales destinadas a tratar y prevenir la hiperplasia de la íntima, basadas en bloqueantes de mTOR tales como everolimus.