Caracterización de variantes de la enterocina AS-48 obtenidas mediante mutagénesis dirigida

Resumen

El antagonismo bacteriano mediado por péptidos de síntesis ribosómica ha ganado un gran interés en los últimos años debido a su posible aplicación en el control de la microbiota indeseable. Estos péptidos, llamados bacteriocinas, se definen como un grupo heterogéneo de sustancias proteicas de síntesis ribosómica (con o sin modificaciones posteriores), que son secretadas extracelularmente por numerosas bacterias Gram-positivas y algunas Gram-negativas. Poseen un modo de acción bactericida frente a estirpes relacionadas. Suelen ser péptidos catiónicos y antipáticos, lo que dirige su acción hacia la membrana citoplasmática,en la que se acumulan provocando su permeabilización. AS-48 es una bacteriocina de 70 aminoácidos producida por Enterococcus faecalis subsp. liquefaciens S-48 y codificada en el plásmido conjugativo pMB2. Se trata de un péptido catiónico e hidrófobo que sufre una modificación post-traduccional consistente en la unión de sus extremos amino y carboxilo mediante un enlace peptídico. La expresión coordinada de los genes de la región as-48, as-48ABCC1DD1EFGH, está implicada en la producción y resistencia frente a esta bacteriocina. AS-48 ejerce una acción bactericida frente a la mayoría de bacterias Gram-positivas y algunas Gram-negativas, causando la permeabilización de la membrana. El amplio espectro de acción de AS-48, su estabilidad en un amplio rango de pH y temperatura y su sensibilidad a proteasas digestivas, la convierten en una prometedora alternativa para su uso como conservante de alimentos. La estructura tridimensional de AS-48, establecida mediante RMN y cristalografía de rayos X, muestra que la molécula posee cinco hélices alfa que se pliegan dando lugar a una estructura muy compacta, en cuyo interior se localizan las cadenas laterales hidrófobas de las hélices. Existe además una superficie hidrófoba expuesta a nivel de las hélices 1,2 y 3. El enlace peptídico cabeza-cola se localiza en mitad de la hélice 5, lo que tiene un marcado efecto en la estabilidad de la molécula. AS-48 posee 14 residuos cargados (8 Lys, 2 Arg y 4 Glu) (pI 10.5) que le confieren una gran carga positiva, la cual se incrementa a pH 3 debido a la protonación de las cadenas laterales de los Glu. En este trabajo, se ha diseñado una estrategia para realizar mutagénesis dirigida en el gen estructural as-48A, utilizando la cepa de E. faecalis JH2-2 transformada con el plásmido pAM401-81x (25 Kb), que contiene toda la región as-48. Además, se ha establecido que la región intergénica entre los genes as-48A y B es decisiva para la expresión de AS-48, ya que el cambio de 3 bases introducido para crear una diana para XhoI ha originado un fenotipo hipoproductor. El análisis transcripcional de las cepas silvestre y mutante de E. faecalis mediante Northern Blot, RT-PCR y primer extension, ha determinado que los genes as-48ABC constituyen una unidad transcripcional. Además, la traducción de AS-48 está regulada a nivel post-transcripcional mediante el procesamiento del transcrito TABC a nivel de la estructura secundaria localizada entre los genes as-48A y B, que da lugar a dos especies de ARNm con una vida media diferente. Para determinar el modo de acción de AS-48, se ha estudiado el papel de siete residuos que podrían estar implicados en la actividad biológica o en la naturaleza hidrofóba de la bacteriocina, realizando para ello mutaciones drásticas (E4A, E20A, E58A, G13K, L40K, W24A y A53S). Los resultados han demostrado que los mutantes E20A, A53S, G13K y L40K mantienen e incluso mejoran la actividad de AS-48, mientras que los mutantes E4A y E58A han reducido su actividad (10-35 veces) frente a la mayoría de cepas Gram-positivas ensayadas. El residuo W24 ha demostrado ser muy importante para la actividad, puesto que su sustitución por Ala ha determinado una pérdida del 40% en la capacidad inhibidora. La estructura secundaria y la estabilidad de las variantes de AS-48 en presencia de calor y GdnHCl ha sido estudiada mediante CD. Todas ellas poseen un alto contenido en hélice alfa, al igual que AS-48, aunque muestran una menor estabilidad. El desplegamiento se ajusta a un modelo de equilibrio de tres estados, indicando la presencia de un intermediario en equilibrio con los estados activo y desnaturalizado.