Characterization of labrenzin biosynthesis in marine alphaproteobacterium Labrenzia sp. PHM005

Laburpena

En las últimas dos décadas, el descubrimiento e investigación de productos naturales han aumentado enormemente debido a los avances en herramientas moleculares y analíticas, así como a la constante demanda de desarrollo de nuevos fármacos, especialmente antibióticos y antitumorales. Los policétidos son uno de los compuestos más diversos de la naturaleza y su actividad biológica es de gran interés para la industria farmacéutica. Este trabajo se estudia la biosíntesis del policétido labrenzina, producida por la alfaproteobacteria marina Labrenzia sp. PHM005 aislada de sedimentos marinos recolectados a una profundidad de 18 m en la costa de Kenia. Este compuesto es un nuevo análogo de la pederina, una de las moléculas más tóxicas encontradas en la naturaleza que ha suscitado interés por el desarrollo de nuevos agentes antitumorales. Hoy en día, más de 30 moléculas diferentes constituyen la familia de policétidos de tipo pederina, que contienen una región central idéntica y extremos variables de policétidos o aminoácidos. Los grupos génicos asociados a su biosíntesis se han identificado mayoritariamente en metagenomas simbiontes, como en el caso de los policétidos pederina, onnamida, psmberina, diaforina y nosperina, lo que dificulta o imposibilita su estudio. Sin embargo, Labrenzia sp. PHM005 es un productor de labrenzina de vida libre que se puede cultivar fácilmente en el laboratorio, lo que ha permitido por primera vez la caracterización en profundidad de un grupo de genes de biosíntesis de pederina. Para ello, el genoma completo de Labrenzia sp. PHM005 se ha secuenciado y se ha identificado el grupo de genes trans-AT PKS de 79 kb responsable de la síntesis de labrenzina. Los análisis bioinformáticos han permitido la caracterización in silico de los genes lab, la identificación de los dominios PKS / NRPS, la delimitación del grupo génico y los conocimientos de ensamblaje a través de análisis comparativos con otros grupos génicos homólogos. Se han desarrollado herramientas de ingeniería genética que han sido útiles para: i) facilitar un análisis funcional de la mayoría de los genes involucrados en la biosíntesis de labrenzina; ii) la detección de compuestos elicitores mediante fusiones traduccionales y iii) la generación de diez nuevos intermediarios de labrenzina y diez análogos híbridos, incluida la pederina. La inactivación de los genes lab3, lab4, lab11 y lab13 que codifican las proteínas HMGS, PKS, ECH y PKS / NRPS, respectivamente, provocó la ausencia de labrenzina y sus intermediarios en los extractos de cultivo PHM005, demostrando que estos genes son esenciales para su biosíntesis. La mutación puntual en el sitio catalítico del dominio tioesterasa (Lab13) provocó una drástica disminución en la síntesis de labrenzina lo que sugiere que la cadena principal de policétidos debe sintetizarse completamente y liberarse del complejo PKS / NRPS para su posterior procesamiento hidrolítico en labrenzina. Además, se demostró que la escisión de policétidos ocurre dentro de las células. Con respecto a la producción de labrenzina, la eliminación de trans-AT Lab9 disminuyó significativamente la producción de labrenzina y sus intermediarios, lo que respalda su papel en la corrección del ensamblaje. Esta mutación también demostró que el trans-AT, Lab10, es suficiente para la biosíntesis de policétidos. Las reacciones de modificación de policétidos son una herramienta útil para generar intermedios à-la-carte. En esta tesis doctoral se ha demostrado que las metiltransferasas Lab6 y Lab16 son responsables de las O-metilaciones del núcleo de labrenzina. Lab6 tiene una función dual y metila secuencialmente los grupos C10-OH y C17-OH. Lab16 metila el C6-OH y su delación provocó la quiralidad de los nuevos intermedios generados. Ambas enzimas son específicas de sustrato y su actividad no es redundante. Por otro lado, fue posible expresar heterólogamente metiltransferasa PedO, codificada en el metagenoma de Paederus fuscipes, y producir por primera vez pederina en una bacteria cultivable. Se demostró que PedO es menos específico de sustrato, ya que catalizó más de una metilación. Este trabajo también reveló que la oxidorreductasa Lab5 está involucrada en la hidroxilación de la posición C7, ya que su eliminación provocó la acumulación de los intermedios que carecen de un grupo -OH. Por otro lado, una deleción en tándem del citocromo P450 Lab7 y la oxidorreductasa Lab8 demostró que ambas enzimas son necesarias para la hidroxilación en la posición C10. Finalmente, los análisis genómicos y transcriptómicos llevados a cabo en Labrenzia sp. PHM005 han revelado nuevos conocimientos sobre la biosíntesis de compuestos de la familia de las pederinas y han sentado las bases para futuros estudios destinados a una mejor comprensión de los mecanismos biosintéticos de los sistemas complejos PKS / NRPS así como sus aplicaciones industriales y el desarrollo de nuevos fármacos.