Enfoques proteómicos para el estudio de la nutrición vegetal

Resumen

El campo de la proteómica en plantas va un paso por detrás del desarrollado en cultivos celulares y microorganismos, y aún está muy alejado del desarrollo en humanos. Sin embargo, en los últimos años se ha incrementado el uso de las nuevas técnicas proteómicas en sistemas vegetales (Jorrín-Novo et al., 2009). Uno de los mayores logros ha sido el establecimiento de una base de datos de MS/MS con entradas de Arabidopsis, Chlamydomonas reinhardtii, Medicago truncatula, Solanum tuberosum (patata), Solanum lycopersicum (tomate) y otras especies vegetales (ProMEX; http://promex.mpimp-golm.mpg.de/home.shtml) (Hummel et al., 2007). El grado de desarrollo de la proteómica vegetal en los últimos años se ve reflejado en el aumento del número de revisiones específicas publicadas que abordan este tema (van Wijk, 2001; Jorrín-Novo et al., 2009; Weckwerth et al., 2008; Komatsu, 2008; Thelen y Peck, 2007; López-Millán et al., 2013). En general, los estudios proteómicos en sistemas vegetales abarcan un amplio espectro, aunque las dos aproximaciones más empleadas son: i) los estudios basados en proteómica diferencial y ii) el mapeo de proteomas de alta complejidad. Entre otras aplicaciones, la proteómica diferencial se ha utilizado en el campo de la nutrición vegetal para el estudio de los cambios inducidos en los perfiles proteicos de raíces de plantas debido a estreses por Fe (López-Millán et al., 2013) y Cd (Rodríguez-Celma et al., 2010), así como en otros proteomas tales como el de apoplasto de remolacha (Ceballos-Laita et al., 2015). El mapeo de proteomas de alta complejidad se ha utilizado, por ejemplo, en la descripción de proteomas de distintos compartimentos (tonoplasto, mitocondria, cloroplasto, etc.) (Salvato et al., 2014; Ferro et al., 2003, 2010) y fluidos vegetales tales como floema y fluido apoplástico (Lattanzio et al., 2013; Ceballos-Laita et al., 2015). El objetivo general de esta Tesis Doctoral consiste en estudiar diversos aspectos relacionados con la nutrición mineral de las plantas utilizando enfoques proteómicos. Esta aproximación experimental nos permite obtener una visión global de los procesos metabólicos implicados en los distintos estreses analizados, así como identificar aspectos nuevos y posibles candidatos o dianas para futuros estudios. Un conocimiento global de los procesos implicados en la nutrición mineral de las plantas nos ayudaría a evitar problemas agrícolas como la deficiencia y toxicidad de metales en cultivos, y a disminuir, por tanto, las pérdidas de productividad. El trabajo pone especial énfasis en el estudio de subproteomas, importantes en la homeostasis de metales pero poco caracterizados hasta la fecha, como son los de savia de floema, membrana plasmática y envolturas cloroplásticas. Además, se evalúa el efecto de algunos estreses nutricionales (deficiencias o toxicidades) sobre varios proteomas de interés, con el fin de aumentar la información existente sobre las respuestas de la planta ante este tipo de desórdenes. Se plantean los siguientes objetivos específicos: 1) Caracterización de los cambios producidos por toxicidades leve, media y severa de Zn en el proteoma de la raíz de remolacha. 2) Caracterización de los cambios inducidos por la deficiencia de Fe en el proteoma y el lipidoma de la membrana plasmática de la raíz de remolacha. 3) Caracterización del efecto de la deficiencia de Fe en el perfil proteico de la savia de floema de Brassica napus. 4) Caracterización de los efectos del exceso de Fe y/o de la inactivación de tres genes de ferritina (atfer1-3-4) en el proteoma, transcriptoma, metaboloma y balance hormonal de flores de Arabidopsis thaliana (WT) y su triple mutante de ferritina (atfer1-3-4). 5) Obtención y caracterización del perfil proteico de las envolturas internas y externas de cloroplastos de guisante por medio de varias aproximaciones proteómicas. En esta Tesis Doctoral llegó a las siguientes conclusiones: 1. La proteómica es una herramienta útil para caracterizar proteomas vegetales, describir los cambios que se producen a consecuencia de estreses nutricionales y generar nuevos puntos de interés para estudios futuros. 2. Las raíces de plantas de Beta vulgaris afectadas por toxicidad leve y moderada de Zn muestran cambios en el metabolismo de carbohidratos para compensar las necesidades energéticas generadas por el estrés. 3. Las raíces de plantas de B. vulgaris cultivadas con altas concentraciones de Zn presentan alteraciones en todas las etapas de la respiración aeróbica, y muestran un desajuste del sistema de defensa ante el estrés oxidativo. 4. En las raíces de plantas de B. vulgaris cultivadas con exceso de Zn, la competencia del Zn con otros metales, especialmente con Fe, es muy relevante: el 61% de las proteínas que muestran cambios en abundancia tienen sitios de unión a metales. 5. En plantas de B. vulgaris, la deficiencia de Fe causa cambios similares en los perfiles proteicos de la membrana plasmática de raíz y de las correspondientes preparaciones de membrana resistente a detergentes. 6. En plantas de B. vulgaris, la deficiencia de Fe produce una disminución de proteínas relacionadas con la fosforilación y el transporte vesicular en la membrana plasmática de raíz, así como un aumento en la asociación de la fosfoenolpiruvato carboxilasa con dicha membrana. 7. En las preparaciones de membrana resistente a detergentes de raíz de B. vulgaris, se observan disminuciones de proteínas pertenecientes a la familia 14-3-3, así como cambios en la asociación de ciertas proteínas citoplasmáticas a dicha membrana. 8. En el floema de Brassica napus, la deficiencia de Fe conduce a cambios en la abundancia de proteínas relacionadas con floración y señalización, así como en el perfil hormonal, confirmando el papel del floema en la trasmisión de señales. 9. En el floema de B. napus, la deficiencia de Fe produce alteraciones en la homeostasis redox y disminuye la capacidad para reparar los vasos cribosos. 10. La alteración de la homeostasis del Fe en plantas de Arabidopsis thaliana debida a la triple mutación en los genes de ferritina y/o al exceso de Fe produce un fuerte impacto en el metabolismo de la flor a nivel de expresión de transcritos, abundancia de proteínas y concentración de metabolitos, así como a un impacto moderado en la concentración de hormonas. 11. Las flores del triple mutante de ferritina de A. thaliana muestran alteraciones a nivel de membrana que afectan a transportadores, metabolismo lipídico y homeostasis redox, que se intensifican como consecuencia del exceso de Fe. 12. El estudio transcriptómico/proteómico/metabolómico realizado con flores de A. thaliana detecta cambios consistentes en al menos dos categorías funcionales, homeostasis redox y metabolismo proteico, y muestra la dificultad de integración de los datos obtenidos por las tres aproximaciones. 13. Proteínas cuya localización precisa era desconocida se han podido asignar específicamente a las envolturas externa e interna del cloroplasto de Pisum sativum. 14. La envoltura interna del cloroplasto de P. sativum está enriquecida en proteínas relacionadas con transporte activo, mantenimiento de la homeostasis proteica, y síntesis de clorofila y tocoferoles, mientras que la externa está enriquecida en proteínas que participan en un rango amplio de procesos. 15. Los estudios con envolturas cloroplásticas muestran que la técnica de ¿shotgun proteomics¿ es complementaria a la electroforesis bidimensional. Ceballos-Laita L, Gutierrez-Carbonell E, Lattanzio G, Vázquez S, Contreras-Moreira B, Abadía A, Abadía J, López-Millán A-F: Protein profile of Beta vulgaris leaf apoplastic fluid and changes induced by Fe deficiency and Fe resupply. Front Plant Sci 2015, 6. Ferro M, Brugiere S, Salvi D, Seigneurin-Berny D, Court M, Moyet L, Ramus C, Miras S, Mellal M, Le Gall S et al: AT_CHLORO, a comprehensive chloroplast proteome database with subplastidial localization and curated information on envelope proteins. Mol Cell Proteomics 2010, 9(6):1063-1084. Ferro M, Salvi D, Brugière S, Miras S, Kowalski S, Louwagie M, Garin J, Joyard J, Rolland N: Proteomics of the chloroplast envelope membranes from Arabidopsis thaliana. Mol Cell Proteomics 2003, 2(5):325-345. Hummel J, Niemann M, Wienkoop S, Schulze W, Steinhauser D, Selbig J, Walther D, Weckwerth W: ProMEX: a mass spectral reference database for proteins and protein phosphorylation sites. BMC Bioinformatics 2007, 8:216. 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