Utilización de la glucosa por prochlorococcuscaracterización del transportador pro1404 y efectos metabólicos

Resumen

RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D./Dª MARIA DEL CARMEN MUÑOZ MARÍN El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis: 1. Introducción o motivación de la tesis Prochlorococcus es un microorganismo fotosintético incluido en el grupo de las cianobacterias, que se ha convertido durante los últimos años en un modelo de investigación de gran interés en ecología marina. Su descubrimiento en 1988 por el equipo de la profesora Sallie W. Chisholm dio lugar a la primera de una serie de publicaciones en revistas científicas de primer nivel (Nature, Science, Microbiology and Molecular Biology Reviews, etc), que pusieron de manifiesto su extraordinaria importancia. Prochlorococcus es probablemente el organismo fotosintético más abundante de la Tierra. Esta abundancia se refleja en una contribución muy importante a la producción primaria global, que diversos estudios cifran alrededor del 30% . Prochlorococcus es, además, el organismo fotosintético más pequeño y de genoma más reducido que se conoce . El equipo dirigido por los profesores Jesús Diez y José Manuel García es pionero en el estudio del metabolismo de Prochlorococcus, y más concretamente, en la asimilación del nitrógeno y el carbono. Uno de los campos de investigación desarrollado por este grupo es la posibilidad de utilización de azúcares por Prochlorococcus. Como organismo fotosintético, Prochlorococcus utiliza el CO2 para producir materia orgánica; no obstante, estudios recientes indican que pese a lo que se creía hasta el momento, Prochlorococcus es un organismo mixótrofo. Estos estudios confirman una vez más, la gran versatilidad metabólica de Prochlorococcus y su capacidad de adaptación a las necesidades derivadas del hábitat en el que sobrevive. 2. Contenido de la investigación: Nuestro interés al estudiar la mixotrofia en Prochlorococcus se basa en el hecho de que esta estrategia metabólica podría conferirle una ventaja ecológica adicional, al suponer un aporte extra tanto de poder reductor como de ATP, de especial importancia en las estirpes de profundidad que reciben una cantidad reducida de luz para llevar a cabo la fotosíntesis. Nuestro grupo ha demostrado la capacidad de absorber glucosa de Prochlorococcus; este hecho provoca una serie de cambios en la expresión génica que sugieren claramente su utilización . Por tanto, los objetivos generales que se han fijado para esta tesis son: - Estudiar el mecanismo de transporte de glucosa utilizado y caracterizarlo. - Análisis de la utilización de glucosa por poblaciones naturales de Prochlorococcus. - Estudiar los cambios en el metabolismo de Prochlorococcus provocados por la adición de glucosa. Para estudiar estos objetivos hemos utilizado la siguiente metodología: 1.1. Estudio del mecanismo de transporte de glucosa en Prochlorococcus y la caracterización del mismo - Indicios previos en nuestro grupo revelaron la posible participación del gen Pro1404 en el transporte de glucosa. Para el estudio de su posible papel como transportador se clonó dicho gen en una cianobacteria incapaz de transportar glucosa como es Synechococcus PCC 7942. Observamos que este gen confiere la capacidad para transportar glucosa. - Por otra parte, se realizó una caracterización cinética del transportador, calculando los valores de Km y Vmax prestando atención especial a concentraciones bajas, representativas de las que se encuentran en el océano. - A continuación, se realizó un estudio del efecto de inhibidores y desacoplantes sobre el transporte de glucosa, lo que permitió obtener información sobre el tipo de transportador implicado indicando que es un transportador activo primario. - Por último, se estudió la especificidad del transportador por la glucosa, con ensayos de competencia con diversos azúcares. 1.2. Estudios de absorción en muestras naturales Un punto de gran importancia en este apartado fue el análisis de la utilización de glucosa por poblaciones naturales de Prochlorococcus. Para ello, contactamos con el equipo del Dr. M. Zubkov (National Oceanography Centre of Southampton, Reino Unido), con el objeto de participar en una campaña oceanográfica de muestreo por todo el Atlántico, desde el 9 de Septiembre hasta el 14 de Noviembre del 2011. A continuación se analizó la utilización de glucosa en las mismas, utilizando sistemas de citometría de flujo en el propio buque de muestreo. De este modo, pretendíamos comprender si existe variabilidad en la tasa de absorción de glucosa, así como si tiene correlación con alguna característica importante de las poblaciones naturales de Prochlorococcus. Además se realizaron estudios de expresión génica con muestras recogidas durante la campaña oceanográfica. 1.3. Cambios en el metabolismo de Prochlorococcus provocados por la adición de glucosa. - Se seleccionaron diversos genes de enzimas implicadas en la utilización de la glucosa para realizar estudios de expresión génica mediante qRT-PCR a tiempo real. De este modo pretendíamos analizar en detalle su regulación, así como su relevancia en la utilización de glucosa por esta cianobacteria. - Se realizó una aproximación proteómica para analizar detalladamente el comportamiento de Prochlorococcus en cultivos a los que se suministro glucosa. Para ello se utilizaron dos aparatos novedosos Waters Synapt HDMS G1 y G2 principalmente y se mostraron resultados preliminares con el espectrómetro de masas Thermo Scientific Q Exactive Ion Flight cuya técnica es más sensible que la electroforesis bidimensional utilizada de forma tradicional para este tipo de proyectos. Para ello, contactamos con el Prof. Robert Beynon del Instituto de Biología Integrativa de la Universidad de Liverpool. Estos estudios nos permitieron descubrir proteínas potencialmente implicadas en la metabolización de glucosa (o confirmar su participación), además de cuantificar los cambios en su abundancia respecto a muestras control. - Se aisló glucógeno a partir de cultivos de Prochlorococcus en los que se añadió glucosa para observar si la glucosa absorbida puede acumularse directamente como reserva. Este experimento tenía como objetivo elaborar un boceto de las rutas utilizadas por Prochlorococcus para metabolizar la glucosa. - Además se midió la liberación de CO2 de los cultivos tras añadirle glucosa, con el objetivo de ver si la glucosa se estaba metabolizando. Todos estos resultados han sido publicados recientemente en la prestigiosa revista PNAS . 3. Conclusiones: 1. El gen Pro1404, anotado como melB, codifica un transportador de glucosa en Prochlorococcus. 2. El transportador Pro1404 muestra una cinética multifásica con una constante Ks de alta afinidad más baja descrita en cualquier microorganismo. 3. Prochlorococcus transporta glucosa a concentraciones nanomolares en el océano Atlántico. 4. Prochlorocococcus es un productor primario capaz de cambiar su metabolismo para beneficiarse energéticamente de las condiciones medio ambientales. 5. Aproximadamente un 3% del total de glucosa transportada en el océano es llevado a cabo por Prochlorococcus y podría contribuir en 1/6 del total del carbono incorporado en este organismo. 6. Nuestros estudios de proteómica y expresión génica indicaron que Prochlorococcus mantiene la maquinaria fotosintética funcional en presencia de glucosa, usando el azúcar como una fuente extra de energía y carbono. 4. Bibliografía: , S., R. Olson, E. Zettler, R. Goericke, J. Waterbury & N. Welschmeyer, (1988) A novel free living prochlorophyte abundant in the oceanic euphotic zone. Nature 334: 340-343. Dufresne, A., M. 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