Aproximación al estudio de bacteriófagos ambientales de medios acuáticos(I) Halófagos de un cristalizador de una salina solar. (II) Fagos de la bacteria marina alteromonas macleodii

Resum

Esta Tesis se engloba en el trabajo desarrollado en el laboratorio de Dr. F. Rodríguez Valera sobre las poblaciones bacterianas en ambientes naturales y el papel que juegan los fagos en su regulación (Rodriguez-Valera, Martin-Cuadrado et al. 2009). La primera parte de la Tesis muestra el estudio de los fagos presentes en un ambiente salino donde la biodiversidad es muy baja y se encuentra dominado principalmente por una única especie, Haloquadratum walsbyi, una arquea cuadrada muy difícil de cultivar en el laboratorio. Mediante secuenciación directa del DNA viral o mediante clonación de éste en librerías de fósmidos, se ha estudiado el conjunto de los genomas virales presentes en un ambiente o metaviroma. La principal ventaja de esta metodología es que permite el estudio de virus ambientales que pertenecen a grupos desconocidos o que infectan a linajes celulares no cultivados o poco conocidos. Por lo tanto, su estudio ya no está limitado al no disponer de un hospedador que se pueda manipular en el laboratorio. En esta parte del trabajo, se utilizó la clonación de DNA viral en fósmidos antes de la secuenciación. De esta manera, se obtuvieron fragmentos de DNA (o ¿contigs¿) de un tamaño similar al de los genomas virales descritos previamente de hábitats salinos. En concreto, se estudió un ambiente extremo con una diversidad relativamente baja: el cristalizador de una salina solar (estanque saturado de cloruro sódico). Gracias a su baja biodiversidad, se simplificó el análisis y la interpretación de los resultados. Un total de cuarenta y dos genomas virales diferentes fueron recuperados, algunos de ellos casi completos. Por su contenido génico, se identificaron tentativamente como genomas de fagos con morfología cabeza-cola perteneciente al orden Caudovirales. Entre ellos, se encontraron un grupo de genomas de fagos que probablemente infecten a H. walsbyi, componente principal de la comunidad microbiana de muchos hábitats hipersalinos. En este caso, la identidad del hospedador pudo confirmarse por la presencia de secuencias de espaciadores CRISPR compartidos por el fago y uno de los genomas de las cepas disponibles de H. walsbyi. Otros grupos virales detectados podrían infectar a Nanohaloarchaea, otro grupo de arqueas recientemente descritas y, también, a la bacteria halófila Salinibacter ruber, otro de los componentes mayoritarios de esta comunidad microbiana. Concluyendo, se ha demostrado que esta aproximación genómica es una alternativa viable para describir la comunidad de virus de una manera más detallada y fiable que las aproximaciones más comunes basadas en secuenciación directa del DNA viral, cuyas lecturas cortas dificultan la identificación funcional de los genes codificados en las secuencias y, raramente, aportan información sobre el posible hospedador. En la segunda parte de la Tesis han sido aislados y secuenciados cuatro nuevos podovirus, los cuales muestran una actividad lítica contra varias cepas de la gamma-proteobacteria marina Alteromonas macleodii. Los alterofagos AltAD45-P1 a P4 fueron aislados a partir de agua recogida cerca de una piscifactoría en Alicante, Mar Mediterráneo Occidental. Su morfología es característica de la familia Podoviridae. Sus genomas lineales y de doble cadena (dsDNA) tienen un tamaño que varía entre 100-104 Kb, un 30% más que el tamaño de cualquier otro podovirus descrito. Los cuatro fagos AltAD45 comparten un 99% de identidad de secuencia nucleotídica en más del 97% de sus ORFs. Sin embargo, se encontró una inserción en AltAD45-P1 y P2 respecto AltAD45-P3 y P4, además de alguna región más divergente. A pesar de la alta similitud de secuencia entre estos cuatro fagos, el grupo con la inserción y el grupo sin ella tienen diferentes rangos de hospedador contra las cepas de A. macleodii testadas. AltAD45-P1 a P4 tienen genes para la replicación y la transcripción del DNA, así como varios genes estructurales similares a los del género N4-like de la familia Podoviridae, los cuales infectan a numerosas Proteobacterias. A pesar de ello, en términos de estructura genética, AltAD45-P1 a P4 difieren de los fagos N4-like. Algunas características distinguibles incluyen la pérdida de un largo gen para una RNA polimerasa que se encapsida en el virión además de una proteína de unión a DNA de cadena simple muy bien conservadas entre todos los fagos N4-like descritos previamente. AltAD45-P1 a P4 difieren también de los virus N4-like en los genes que codifican proteínas de la cola. Por lo tanto, concluimos que los fagos AltAD45 caracterizados en esta Tesis constituían per se un nuevo género dentro de los Podoviridae, y se han denominado AltAD45-like.