Nuevos mecanismos transformantes de MYC: inducción de SKP2 y degradación de p27= New MYC transforming mechanisms : induction of SKP2 and degradation of p27

Resumen

INTRODUCCIÓN. MYC es uno de los oncogenes más frecuentemente desregulados en cáncer humano. A través de su papel como factor de transcripción, MYC regula la expresión de cientos de genes que participan en diversas funciones celulares como la regulación del ciclo celular, la diferenciación y el metabolismo. La sobreexpresión de MYC, a los niveles encontrados en las células cancerosas, es suficiente para producir la entrada en fase S de células quiescentes, para acelerar la tasa de proliferación celular, y para prevenir la salida del ciclo celular. p27 (KIP1) es un inhibidor de CDKs que restringe la transición de las células a través de la fase G1-S y detiene la progresión del ciclo celular. En la mayoría de los tumores humanos, bajos niveles de p27 suelen estar asociados con un peor pronóstico de la enfermedad. Los niveles de MYC y p27 se correlacionan inversamente en muchos tumores, y se ha demostrado en diversos modelos celulares, que la sobreexpresión MYC antagoniza el efecto antiproliferativo de p27. Sin embargo, los mecanismos que median este antagonismo no se comprenden aún del todo. Por ello, en este trabajo hemos decidido profundizar, y en su caso encontrar mecanismos moleculares que puedan explicar el antagonismo entre MYC y p27 en diferentes contextos experimentales. RESULTADOS. Previamente, utilizando tecnología de microarrays, encontramos que la activación de MYC en las células K562 regulaba la expresión de SKP2 a nivel de ARNm (Acosta et al., 2008). SKP2 es una proteína F-Box del complejo ligasa de ubiquitinas SCF, que tiene a p27 como uno de sus principales sustratos para la proteólisis. SKP2 se encuentra frecuentemente sobreexpresado en cáncer humano, asociado con la progresión tumoral e inversamente correlacionado con p27. De hecho, la actividad oncogénica de SKP2 se atribuye principalmente a la degradación de p27. Utilizando diferentes sublíenas celulares con expresión condicional de MYC derivadas de la línea de leucemia humana K562, hemos encontrado que MYC induce la expresión de SKP2 a nivel de ARNm (por RT-qPCR) y de proteína (por inmunoblot). Esta inducción de SKP2 era independiente de la estimulación de la proliferación mediada por MYC. Por otro lado, el silenciamiento de MYC mediante siRNA dio lugar a la disminución de SKP2 en células K562. Además, encontramos que MYC regulaba la expresión de SKP2 en otras dos líneas celulares con expresión condicional de MYC como línea linfoide humana (P493.6) y las células epiteliales de visión (TM1); y que los niveles de SKP2 estaban notablemente disminuidos en fibroblastos de rata deficientes en MYC (células HO.15.19). MYC fue capaz de incrementar la expresión de SKP2 a nivel de ARNm en presencia de un inhibidor de la síntesis de proteínas en células K562, sugiriendo que MYC era un activador directo de SKP2. Mediante ensayos luciferasa observamos que MYC activaba el promotor de SKP2 humano y mediante experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina demostramos que MYC se unía a la región reguladora 5´ del gen SKP2 humano que incluía dos cajas E, confirmando que SKP2 era un nuevo gen diana de MYC. Dado que la línea celular K562 deriva de una leucemia mieloide crónica humana (LMC), se estudiaron un grupo de 39 muestras de CML y se encontró una correlación entre los niveles de MYC y SKP2 a nivel de ARNm. Además, utilizando las bases de datos Oncomine y GeneSapiens encontramos que la expresión de MYC y SKP2 se correlaciona también en otras dos neoplasias hematológicas como la leucemia mieloide aguda y el linfoma. Por otra parte, se observó que, en las células K562, MYC promovía la fosforilación de p27 en la treonina 187 a través de la inducción de la ciclina A y la actividad quinasa asociada a dicha ciclina. Esta fosforilación es requerida para el reconocimiento de p27 por parte del complejo SCF SKP2. Además se encontró que, en fibroblastos embrionarios de ratón, MYC era capaz de promover dicha fosforilación independientemente de la presencia de CDK2 o de ciclinas E. La inducción de SKP2 por MYC se correlacionaba con la disminución de los niveles de p27 en las sublíneas derivadas de K562. El silenciamiento de SKP2 mediante siRNA dio como resultado el aumento de p27 a nivel de proteína, dando lugar a una disminución de la tasa proliferativa de las células K562 y a una reducción de la capacidad tumorogénica de estas células en xenoinjertos en ratones desnudos. El silenciamiento de SKP2 no tuvo ningún efecto sobre la estabilidad o la actividad de MYC. Finalmente, mediante cromatografía de filtración en gel, observamos que p27 se acumulaba en forma libre cuando éste se sobreexpresaba a altos niveles dentro de las células K562, lo que se asociaba con un bloqueo total de la proliferación y que la desaparición de p27 en forma libre se correlaciona con el estímulo proliferativo mediado por MYC. CONCLUSIÓN. En conjunto, nuestros datos muestran que, al menos en células K562, MYC orquesta o dirige una serie de mecanismos que incluyen la regulación del oncogen SKP2 y la ciclina A, la estimulación de la actividad quinasa de las CDKs asociadas a la ciclina A y la inducción de la fosforilación de p27 en Thr-187, para promover la degradación final de p27. A través de estos mecanismos, las células malignas que sobreexpresan MYC adquirirían una ventaja proliferativa con respecto a las células no transformadas.