Identificación de un nuevo sistema de dos componentes y tres proteasas implicados en la respuesta al estrés por secreción en Streptomyces lividans

Resumen

La acumulación de proteínas mal plegadas fuera de la membrana citoplasmática de la bacteria puede interferir con la maquinaria de secreción, es por ello que la existencia de factores de control de calidad que eliminen las proteínas mal plegadas resulta de gran importancia en bacterias que son productoras eficientes de proteínas de secreción. Para responder al estrés producido por la acumulación de proteínas incorrectamente plegadas estas bacterias normalmente emplean sistemas de dos componentes específicos que activan la expresión de proteasas de tipo HtrA que eliminan de forma específica las proteínas extracelulares plegadas incorrectamente (Sarvas y col., 2004). La sobreproducción de alfa-amilasa en S. lividans, una bacteria Gram-positiva frecuentemente empleada para la producción industrial de proteínas, provoca un estrés por secreción producido por acumulación de alfa-amilasa incorrectamente plegada. En estas condiciones, hemos identificado un sistema de dos componentes (CssR-CssS) que regula la transcripción de tres genes que determinan la síntesis de proteasas de tipo HtrA, las cuales parecen estar implicadas en la respuesta a este estrés. Estirpes mutantes en cada uno de los genes que forma parte del operón que codifica el sensor (CssS) y el regulador (CssR), acumulan proteína no funcional fuera de la célula, confirmando que este sistema de dos componentes está implicado en la respuesta al estrés por secreción en S. lividans. Ensayos de retardo en gel con el regulador CssR purificado nos han permitido establecer que los genes que codifican las tres proteasas de tipo HtrA, así como el primer gen del operon del sistema de dos componentes, parecen ser dianas de regulación directa de CssR. Por otra parte, mutaciones en cada uno de los genes de las proteasas sugieren que la acción conjunta de las tres proteasas es necesaria para la eliminación de la proteína incorrectamente plegada. Adicionalmente, la sobreproducción de cualquiera de los genes de las proteasas provoca una disminución de la cantidad de alfa-amilasa activa, apuntando a que un exceso de una de las proteasas puede causar una descompensación en su acción, provocando efectos negativos en la calidad de la proteína secretada. Misfolded proteins accumulating outside the bacterial cytoplasmic membrane can interfere with the secretory machinery, hence the existence of quality factors to eliminate these misfolded proteins is of vital importance in bacteria that are efficient producers of secretory proteins. These bacteria normally use a specific two-component system to respond to the stress produced by the accumulation of the misfolded proteins, through activating the expression of HtrA-like proteases to specifically eliminate the incorrectly folded extracellular proteins (Sarvas y col., 2004). The overproduction of alpha-amylase causes secretion stress in S. lividans, a Gram-positive bacteria used for industrial protein production, due to the accumulation of misfolded alpha-amylase. Under this condition, we have identified a two-component system (CssR-CssS) that regulates three HtrA-like proteases, which appear to be involved in secretion stress response. Mutants in each of the genes forming part of the two-genes operon that encodes the sensor (CssS) and regulator protein (CssR) components accumulated misfolded proteins outside the cell, strongly suggesting the involvement of this two-component system in the S. lividans secretion stress response. Electrophoretic mobility shift assays with the purified CssR regulator allowed us to establish that the three HtrA-like proteases genes, as well as the first gene of the two-components operon, seems to be targets of direct regulation from CssR. On the other hand, mutations in each of the protease genes suggest that all of them are necessary together for the elimination of the misfolded protein. Additionally, the overproduction of any of the protease genes produces a depletion of the active alpha-amylase, suggesting that an excess of any of the proteases could cause an imbalance in their action, negatively affecting the quality of the secreted protein. palabras clave serían: Streptomyces, Streptomyces lividans, secreción, Sec, Tat, agarasa, amilasa, estrés por secreción, CssR, CssS, HtrA, proteasa, sistemas de dos componentes, regulación, bacteria, sensor