Structural and biochemical characterization of proteins involved in the shynthesis of triglycerides and polyunsaturated fatty acids

Resumen

Introducción Los lípidos son moléculas que se encuentran en todas las células vivas y están formados por cadenas de hidrocarburos. Éstos forman estructuras importantes como las membranas celulares y también son utilizados como reservorio de energía o incluso actúan como moléculas de señalización (Berg, Tymoczko, and Stryer 2002a; Pucci, Chiovato, and Pinchera 2000). Este trabajo de tesis está enfocado en el estudio de dos familias de proteínas productoras de lípidos de interés comercial: los triglicéridos y los ácidos poliinsaturados omega-3. Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos con una cadena alifática y con un número par de átomos de carbono. De acuerdo con el número de carbonos que poseen éstos se clasifican generalmente en tres grupos: ácidos grasos de cadena corta (menos de 6 carbonos), de cadena media (6-10 carbonos) y cadena larga (más de 12 carbonos). Los ácidos grasos pueden ser saturados (sin doble enlace), insaturados (con un doble enlace) o poliinsaturados (PUFA) (con más de 1 doble enlace) (Chow 1999). El enlace doble puede ocurrir en una configuración cis-,cuando los átomos de hidrógeno adyacentes se sitúan al mismo lado de la cadena, o trans-, (cuando se encuentran en posiciones opuestas) (Keweloh and Heipieper 1996). Los ácidos grasos se pueden encontrar en las células en forma de triglicéridos (TAG) como forma principal de almacenamiento de energía. Al mantener los ácidos grasos almacenados en moléculas TAG, la célula experimenta cambios de presión osmótica y evita toxicidades, normalmente asociadas a la existencia de ácidos grasos libres. Tanto los TAG como los ácidos grasos poliinsaturados presentan muchas propiedades interesantes tanto para la industria como para la salud y bienestar humano. Los TAG son moléculas que han sido históricamente utilizadas para muchos propósitos como la producción de aceites utilizados en cocina o la fabricación de todo tipo de grasas y cosméticos. Al ser moléculas muy energéticas con unas propiedades muy características pueden ser fácilmente utilizados para la producción de biodiesel (Balat 2009; Fox and Stachowiak 2007). Históricamente los TAG para fabricar biodieseles se obtienen a partir de biomasa de plantas extraídas de cultivos masivos, principalmente aceite de palma, soja y colza (Metzger and Meier 2011). Las áreas utilizadas para estos cultivos compiten con el uso del suelo con los cultivos de vegetales para el consumo humano, generando de este modo un problema de recursos evidente, más aun si se tienen en cuenta los procesos de industrialización que aumentan la demanda de combustibles fósiles (Hajjari et al. 2017). Los PUFAs, especialmente los ácidos grasos omega 3 también son moléculas con un gran interés, especialmente desde el punto de vista médico. El término omega-3 hace referencia a la posición de su primer doble que se encuentra alejado tres carbonos del extremo metil del ácido graso. Éstos ácidos grasos son largos (con más de 12 carbonos) poseen al menos 2 insaturaciones que se encuentran siempre en configuración cis-. Los PUFAS más relevantes en la naturaleza se conocen como ácido araquidónico (ARA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA). Éstos ácidos grasos son esenciales y se ha visto que en mamíferos su consumo está directamente relacionados con una disminución en la aparición de ciertos tipos de cáncer, con la reducción de procesos inflamatorios, alergias o con la protección del sistema vascular y el nervioso (Cole et al. 2005; Rose and Connolly 1999; Ruxton et al. 2004). Se ha estudiado que en mamíferos existe una deficiencia en la producción de este tipo de ácidos grasos y por ello es necesaria una ingesta en la dieta. La forma de obtención en la actualidad de estos ácidos grasos omega-3 es a partir del aceite de pescado, ya que la fuente principal de producción de los mismos se encuentra en ciertas comunidades bacterianas en los ecosistemas marinos. De este modo se genera de nuevo un problema de recursos ya que las limitaciones naturales en la extracción de pescado imposibilitan satisfacer la demanda mundial de éste tipo de complementos para la alimentación. Ya que ambas moléculas, TAGs y PUFAs, son interesantes desde el punto de vista biológico e industrial nos planteamos estudiar las proteínas que originan su síntesis en bacterias y profundizar en los conocimientos que tenemos de ellas desde un punto de vista de la ingeniería de proteínas, la biología estructural y la bioquímica. De este modo podremos utilizar sus capacidades de síntesis y modificarlas a nuestro antojo para ser utilizadas en organismos heterólogos fáciles de manipular en el laboratorio, como la bacteria Escherichia coli. Los triglicéridos son sintetizados por células eucariotas de una forma generalizada, pero su síntesis en procariotas está restringida únicamente a algunas bacterias aerobias heterotróficas y algunas cianobacterias. Concretamente dentro del género Actinomycetes han sido descritas varias bacterias con capacidades para sintetizar TAG y ceras como Mycobacterium sp., Nocardia sp., Rhodococcus sp., Micromonospora sp., Dietzia sp., Gordonia sp. y Streptomycetes (Manilla-Pérez et al. 2011; Santala et al. 2014). Estos organismos pueden utilizar muchas fuentes de carbono diferentes para producir TAG y por ello existe un interés en la industria para utilizarlos de modo que puedan transformar sustancias de deshecho en productos útiles como biocombustibles (Nigam and Singh 2011). Las rutas bioquímicas utilizadas por estos microorganismos son diferentes de las utilizadas por organismos eucariotas, especialmente el último paso de la síntesis en el que se condensan un ácido graso con un diglicérido. Para realizar este paso enzimático estas bacterias poseen una enzima denominada como WS/DGAT del término en inglés “wax ester synthase/acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase” (Kalscheuer and Steinbüchel 2003). Éste término hace referencia a que la enzima tiene una capacidad bifuncional, siendo capaz de producir ceras o triglicéridos dependiendo del sustrato utilizado. En nuestro laboratorio hemos descubierto recientemente una enzima de ésta familia perteneciente al organismo Thermomonospora curvata (la cual nombramos como tDGAT) y que ha demostrado capacidad para producir rápidamente TAG cuando es expresada en E.coli (Lázaro et al., 2017, in press). Puesto que este sistema de producción no es óptimo debido a las diferencias intrínsecas entre el organismo original y el hospedador en el que se realiza la expresión heteróloga creemos que el sistema puede ser mejorado. Para ello nos hemos planteado utilizar un mecanismo de evolución dirigida para modificar la proteína y hacer que el sistema de acumulación funcione mejor, ya sea por mejoras en la catálisis o por el acondicionamiento de las interacciones entre la proteína y el sistema de membranas de E.coli. Los ácidos grasos saturados o monoinsaturados se sintetizan de un modo generalizado mediante unas proteínas llamadas ácido graso sintasas o FAS. Estos sistemas de proteínas se presentan en la naturaleza organizados de dos formas, formando grandes polipéptidos en los que se pueden diferenciar dominios catalíticos individuales, en cuyo caso son clasificados como FAS tipo I, o en proteínas individuales con dominios claramente separados en polipéptidos diferentes, en cuyo caso se trata de los sistemas FAS tipo II. El primer sistema es típico de mamíferos y hongos y el segundo es típico de bacterias (Bloch and Vance 1977; Campbell and Cronan 2001). En ambos sistemas encontramos los mismos dominios catalíticos característicos que producen la serie de reacciones iterativas necesarias para producir ácidos grasos: ACP o “acyl carrier protein” cuya función es la de portar los intermediarios unidos covalentemente y transferirlos al resto de dominios; la AT o acil transferasa que selecciona los bloques moleculares de malonil-CoA con los que se va a construir la nueva molécula, la KS o keto sintasa que realiza las condensaciones con las que aumenta el tamaño del ácido graso en dos carbonos; y los dominios modificadores KR o keto reductasa, DH o dehidratasa y ER o enoil reductasa, que reducen los grupos ceto generados en las condensaciones y generan el patrón de dobles enlaces característico (Beld, Lee, and Burkart 2014). Los ácidos grasos poliinsaturados son sintetizados mediante dos rutas diferentes en la naturaleza: la ruta aerobia y la anaerobia. La más común de ellas es la ruta aerobia además de ser la mejor estudiada por estar ampliamente representada en plantas y animales. Esta ruta se caracteriza por la presencia de desaturasas y elongasas que incorporan unidades de malonil nuevas e insaturaciones nuevas a los ácidos grasos previamente existentes generando de esta forma ácidos grasos poliinsaturados (Lee et al. 2016). Estas rutas son extremadamente complicadas desde el punto de vista de la ingeniería genética, por lo que siempre ha existido una ambición por la búsqueda de rutas más simples que puedan ser manipuladas en el laboratorio. Se conoce una ruta alternativa para la producción de ácidos grasos omega 3 conocida como la ruta anaerobia. Esta ruta es llevada a cabo por gamma-proteobacterias marinas como Shewanella pealeana o Moritella marina las cuales son capaces de producir grandes cantidades de PUFAs (Nichols et al. 1999) utilizando moléculas básicas como el malonil y el acetil. Para realizar esta ruta de síntesis poseen clusters genéticos compuestos por 4-5 pautas abiertas de lectura denominados pfa sintasas (Okuyama et al. 2007; Orikasa et al. 2004). Éstos poseen alta homología con los dominios enzimáticos involucrados en la síntesis de ácidos grasos convencionales (Yazawa 1996b) y tienen una organización modular que recuerda a las FAS tipo I y a las poliketido sintasas bacterianas (PKs) , por lo que se presupone que su síntesis debería ser similar. Desgraciadamente con la información existente hasta la fecha no se ha podido proponer un modelo coherente y sólido que explique la totalidad del mecanismo de síntesis de PUFAs por esta vía de las pfa sintasas. Por este motivo se ha planteado el objetivo de estudiar la biología estructural y la bioquímica de los dominios implicados en esta ruta para profundizar en la medida de lo posible en el desarrollo de un modelo definitivo. Resultados y Discusión Evolución dirigida de tDGAT Se ha sometido a la proteína tDGAT a un proceso de evolución dirigida in vitro con el objetivo de mejorar la productividad de la misma cuando es expresada en E.coli y conseguir de esta forma una acumulación de triglicéridos y ceras más eficiente. Además de este objetivo se pretende adquirir ciertos conocimientos estructurales de la proteína. Esta información resultará útil para comprender el mecanismo enzimático de las proteínas WS/DGAT ya que no existe ninguna estructura disponible hasta la fecha. Para mejorar la proteína se ha diseñado un sistema de evolución dirigida in vitro. El primer paso ha sido la obtención de variabilidad genética utilizando para ello la técnica de mutagénesis aleatoria por PCR (K and M 2002), introduciendo así mutaciones al azar en el fragmento a mutar de la proteína. Después se ha generado una librería de mutantes mediante el proceso de megawhop (Miyazaki 2011) que se ha electroporado a bacterias E.coli competentes. Para seleccionar los mutantes que presentaron una mejora en la acumulación de TAG y ceras se puso a punto un sistema de selección basado en un colorante que aporta fluorescencia en presencia de lípidos neutros, el rojo nilo (Greenspan, Mayer, and Fowler 1985). Con la ayuda de este colorante discriminamos entre las diferentes variantes de la proteína, siendo capaces de analizar una librería de más de 10.000 mutantes (puntuales en su mayoría). Se seleccionaron 6 mutantes puntuales y un mutante triple con una producción mejorada de TAG y 4 mutantes cuya producción de TAG había sido completamente bloqueada pero que conservaban producción de ceras. Estos mutantes fueron comprobados y analizados por cromatografía en capa fina. La mayoría de las mutaciones beneficiosas para la producción de TAG mapeaban en el dominio N-terminal de la proteína, y más concretamente en la superficie de la misma. Además de esto, solamente se seleccionaron mutaciones que disminuían el índice de hidrofobicidad superficial, por lo que entendemos que la mejora en la producción está relacionada de alguna forma con cambios en las interacciones proteína-membrana, ya que éstas son presumiblemente fundamentales en la formación de las gotas lipídicas (Stöveken et al. 2005). En relación a las mutaciones encontradas que bloqueaban selectivamente la producción de TAG pero no la de ceras, no tenemos una explicación completa que explique este fenómeno, pero es probable que las interacciones superficiales de la proteína con los lípidos de membrana o con otras proteínas sean de alguna forma responsables de estos fenotipos. Para analizar cuantitativamente la mejora en la producción de triglicéridos obtenida se utilizó un sistema de densitometría para medir resultados de cromatografía en capa fina. De esa forma se compararon las producciones de TAG y ceras de los 4 mutantes obtenidos más productivos, obteniéndose valores de hasta un 350% más producción para el mutante P35L. También analizamos la sobreexpresión de la proteína tDGAT y sus variantes seleccionadas mediante geles de SDS-PAGE, no observándose cambios en la cantidad de proteína soluble producida. De este modo pudimos descartar que cambios en la solubilidad pudiesen estar influenciando la producción de lípidos neutros. Finalmente, mediante experimentos de ultracentrifugación pudimos comprobar como la proteína tDGAT tiende a unirse a las membranas celulares de E.coli y a la fracción lipídica de TAGs, manteniéndose unida a éstos lípidos y formando cuerpos de inclusión. De esta forma aportamos un dato experimental que apoya la hipótesis de que las interacciones proteína-lípidos probablemente juegan un papel fundamental en este tipo de síntesis. En este caso, la insolubilidad de la proteína tDGAT aporta un ambiente hidrofóbico que resulta clave para la preservación de los TAG en forma de cuerpos lipoprotéicos. Estudio bioquímico y estructural de sintasas de ácidos grasos omega-3 Se ha realizado un estudio bioquímico y estructural de los dominios presentes en las sintasas de ácidos grasos poliinsaturados de bacterias marinas. Para ello se ha escogido el organismo Moritella marina como modelo para estudiar el clúster pfa para la producción de DHA. Debido al carácter modular de las proteínas presentes en este sistema, se realizaron diferentes construcciones representativas para obtener al menos una proteína soluble por cada uno de los dominios con las que una vez purificadas realizar los experimentos de cristalización y bioquímica según el caso. Para la correcta definición de los dominios individuales presentes en nuestro sistema pfa se realizó un estudio bioinformático previo que ayudó a definir correctamente cada una de las unidades funcionales del sistema. Mediante clonación con la técnica de isothermal assembly se consiguió producir menos una construcción soluble para cada uno de los dominios de este complejo protéico. Una vez purificadas las proteínas, se realizaron ensayos de cristalización probando hasta 96 condiciones diferentes para cada una de ellas y diferentes concentraciones. Se obtuvieron cristales repetibles una construcción del módulo N-terminal de pfaC, que codifica para un dominio keto sintasa- chain length factor (KS-CLF), previamente descrito como elemento central en la síntesis de algunos policétidos de cadena larga. Estos cristales pertenecientes al grupo espacial P21P21P21 difractaron a una resolución 1.85 Å midiendo su celdilla unidad a=78.23 Å; b=90.83 Å; c=132.42 Å. La estructura fue finalmente obtenida por reemplazo molecular utilizando como modelo el núcleo conservado de la proteína curacin policétido sintasa (4MZ0). La arquitectura general de la proteína presenta dos motivos confrontados con un plegamiento similar al visto anteriormente para otros dominios KS. Cada uno de éstos tiene un plegamiento carácterístico de las proteínas tiolasas, similar a las proteínas encontradas en las FAS (Hopwood and Sherman 1990; White et al. 2005). La característica del dominio C-terminal o CLF es que no presenta la triada catalítica de C-H-H, sino que la cisteína está reemplazada por un ácido glutámico, de una forma similar a los dominios homólogos encontrados en PKS (Keatinge-Clay et al. 2004). Encontramos una diferencia fundamental en nuestra estructura: la presencia de un motivo en la parte superior de la proteína formado por cuatro hélices alfa y que mantiene el dímero intramolecular fuertemente pegado. La presencia de este motivo resulta fundamental a la hora de emitir hipótesis acerca del estado oligomérico de la proteína completa pfaC. Ésta debería encontrarse formando monómeros con una probabilidad alta debido a la imposibilidad de que el dominio KS se disocie para formar dímeros intermoleculares. Así como otros dominios KS-CLF en PKSs tienen actividad decarboxilasa contra malonil (Beltran-Alvarez et al. 2007; Bisang et al. 1999; Carreras and Khosla 1998; Kong et al. 2008; Liew et al. 2012; Sun et al. 2009), en nuestro caso, a pesar de haber intentado cocristalizar la proteína con éste sustrato, no hemos conseguido ver diferencias en el mapa de densidad electrónica que indiquen la incorporación de unidades de carbono a ninguno de los centros activos. Además de esto, experimentos bioquímicos con malonil y acetil CoA marcados con radiactividad realizados en nuestro laboratorio sugieren de nuevo que nuestra proteína KS-CLF tiene que funcionar preferentemente con otro tipo de sustratos más complejos. La presencia de un túnel hidrofóbico conectando ambos centros activos en nuestra estructura también ha sido descrita anteriormente para otras KS-CLF (Keatinge-Clay et al. 2004). Éste podría tener un papel protector a la hora de polimerizar la cadena de carbonos, impidiendo reacciones de oxidación anómalas antes de finalizar la síntesis de DHA. Se necesitan más estudios que identifiquen el sustrato preferente para proteinas KS-CLF y de ese modo desarrollar un modelo que incluya a éstos en la síntesis de omega-3. Además de los estudios estructurales previamente descritos se han realizado ensayos de unión proteína-sustrato con acetil y malonil CoA marcados con carbono 14. En estos experimentos se han utilizado los dominios acyl carrier protein (ACP), keto sintasa (KS) y acil transferasa (AT) del dominio pfaA. De este modo se pretendió caracterizar la especificidad de los mismos y desarrollar un modelo preliminar que explique algunos de los pasos de la síntesis de DHA. Tras incubar estos dominios con ambos sustratos radioactivos se pudo comprobar que las ACPs en su forma “holo” son capaces de unir malonyl selectivamente sin la ayuda de ningún dominio AT. Esta habilidad para auto malonilarse ya había sido descrita con anterioridad para otras ACP de PKSs pero nunca para las ACP de complejos pfa (Arthur et al. 2005). Las ATs, tanto de pfaA como de pfaB fueron capaces de unir selectivamente malonil y transferírselo a las ACP, por lo que poseen la habilidad de seleccionar unidades extensoras. Cuando el dominio KS-AT fue mutado en su residuo catalítico responsable de la transferencia de malonil (S707A) sorprendentemente éste adquirió la habilidad de unir acetil y de cargarlo a las ACPs. Quizás este resultado indique que el dominio AT impide la unión de acetil al centro activo de la KS cuando su serina se encuentra en un estado funcional. Con estos experimentos hemos demostrado que pfaA posee todos los dominios necesarios para secuestrar las unidades de malonil en sus ACP mediante la acción selectora de su dominio AT. Una vez cargadas estas unidades de malonil, al poseer un dominio KS, la proteína pfaA podria realizar las primeras rondas de condensación y posteriormente de reducción, debido a la presencia de dominios modificadores KR y DH, preparando de esta forma las unidades extensoras del sistema. Se ha descubierto la presencia de un residuo conservado en el dominio KR de pfaA (D2177) que indica que el producto de este dominio será un isómero de tipo D-, que son procesados normalmente por los módulos DH adyacentes generando moléculas con dobles enlaces trans- (Akey et al. 2010; Reid et al. 2003; Weissman 2017). Éstos a su vez son normalmente reducidos por el dominio ER, a no ser que sufran una isomerización (Weissman 2017). Nuestro modelo de síntesis propone que los dobles enlaces que saldrían de las unidades extensoras maduras generadas en pfaA serán de tipo trans-. pfaC será el encargado de condensar estas unidades extensoras debido a su homología estructural con los dominios KS-CLF de sistemas PKS y de sus módulos adyacentes DH, que isomerizarán solamente los dobles enlaces que vayan a permanecer en la estructura final de DHA. De este modo proponemos un modelo que en esencia se trata de un proceso unidireccional muy parecido al presente en PKS tipo I y no iterativo como en el caso de los sistemas FAS. Bibliografía • Akey, D.L., Razelun, J.R., Tehranisa, J., Sherman, D.H., Gerwick, W.H., and Smith, J.L. (2010). Crystal Structures of Dehydratase Domains from the Curacin Polyketide Biosynthetic Pathway. Struct. Lond. Engl. 1993 18, 94–105. • Arthur, C.J., Szafranska, A., Evans, S.E., Findlow, S.C., Burston, S.G., Owen, P., Clark-Lewis, I., Simpson, T.J., Crosby, J., and Crump, M.P. (2005). Self-malonylation is an intrinsic property of a chemically synthesized type II polyketide synthase acyl carrier protein. Biochemistry (Mosc.) 44, 15414–15421. • Balat, M. (2009). Biodiesel Fuel from Triglycerides via Transesterification—A Review. Energy Sources Part Recovery Util. Environ. Eff. 31, 1300–1314. • Beld, J., Lee, D.J., and Burkart, M.D. (2014). 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