Estudio estructural y funcional del arnp del virus de la gripe

Resumen

SUMMARY 21 INTRODUCCIÓN 23 El Virus de la Gripe 25 1. Historia 2. Clasificación y Nomenclatura 3. La partícula viral - Proteínas Virales 4. RNAs virales La Ribonucleoproteína del Virus de la Gripe 29 1. La polimerasa viral - PB PB 1 - PB PB 2 - PA PA 2. La nucleoproteína Ciclo de Infección Viral 35 1. Entrada de las partículas Virales 2 . Transcripción, replicación y expresión génica 3 . Procesamiento de los RNAs virales y síntesis de proteínas 4 . Formación y salida de nuevas partículas virales Procesos de Replicación y Transcripción del Virus de la Gripe 38 1. Transcripción viral 2 . Replicación viral Factores Celulares asociados a las RNPs 40 Estudio Estructural de Maquinarias de Replicación 41 1. Abordajes tridimensionales 2 . Requerimientos 3 . De la Observación al microscopio a la obtención de un m odelo 3D - El procesamiento de la imagen - A nálisis bidimensional - R econstrucción tridimensional de partículas in dividuales OBJETIVOS 47 MATERIALES Y MÉTODOS 51 Materiales 53 1 . Líneas Celulares 2 . Bacterias 3 . Virus 4 . Plásmidos 5 . Anticuerpos 6 . Resinas de Cromatografía Métodos 53 Manipulación del DNA y Clonajes 1. Construcción del plásmido pCMV CMV PB PB 2-HIS IS 2 . Construcción del plásmido pHH clon 23 3 . Mutantes de NP NP Generación y Titulación de vTF7-3 1. Generación de stocks de virus 2 . Titulación mediante ensayo en placa Manipulación de cultivos celulares 1. Reconstitución de RNP RNP RNP s in vivo 1.1 Para análisis estructural 1.2 Para ensayos de complementación 2. Reconstitución de polimerasa in vivo 3 . Expresión de nucleoproteína 4 . Obtención de extractos celulares Purificación de RNPs Paso1. Purificación de RNP RNP RNP s por cromatografía de a finidad P P P aso 2. Purificación de RNP RNP RNP s por cromatografía de e xclusión molecular P P P aso 3. Concentración de RNP RNP RNP s por cromatografía d e afinidad Análisis de proteínas 1 . Western Blot 2 . Tinción de geles y membranas 3 . Determinación de proteína CAT CAT CAT 4 . Purificación de oligómeros de nucleoproteína por cromatografía de exclusión molecular Manipulación del RNA 1 . Transcripción in vitro de las RNP RNP RNP s 2 . Digestión controlada del RNA RNA RNA 3 . Marcaje del RNA RNA RNA Microscopía 1 . Tinción negativa 2 . Criomicroscopía electrónica 3 . Digitalización y procesamiento de imágenes 4 . Docking RESULTADOS 63 Determinación de la Estructura Tridimensional de la RNP Recombinante del Virus de la Gripe 65 1. Generación de RNPs recombinantes 1 .1 Reconstitución de RNP RNP RNP s 1.1.1 Líneas celulares, plásmidos y reactivos de transfección 1.1.2 Reconstitución estándar 1 .2 Purificación de RNP RNP RNP s 1.2.1 Selección y optimización de los métodos y tampones de purificación 1.2.2 Purificación estándar 2. Análisis estructural de la RNP recombinante 2 .1 Modelo de la RNP RNP RNP por ME ME de muestras teñidas 2 .2 Estructura de la RNP RNP RNP por criomicroscopía electrónica 2 .3 Localización de las subunidades en la estructura del complejo de la polimerasa 2 .4 Docking de la estructura atómica de la NP NP en el a nillo de NP NP 2 .5 Estudio de la localización del RNA RNA RNA en la RNP RNP RNP del v irus de la gripe Análisis Funcional de la RNP del Virus de la Gripe 76 1. Mutantes de NP en la zona de interacción NP-NP 2 . Mutantes de NP en la zona de interacción NP -polimerasa Análisis Estructural y Funcional del Proceso de Transcripción 81 1. Análisis estructural del proceso de transcripción 2 . Análisis genético del proceso de transcripción DISCUSIÓN 89 1. Análisis estructural de la RNP 91 1.1 La estructura de la RNP 1 .2 El anillo de NP 1 .3 La posición del RNA 1 .4 Estructura de la polimerasa y localización d e los dominios de las subunidades 1 .5 Resumen final de la estructura de la RNP 2. Nuevo Modelo de Transcripción Viral 97 2.1 Estudio del proceso de transcripción 2 .2 ¿Puede una RNP silvestre complementar a otra R NP defectiva en transcripción? 2 .3¿Puede una polimerasa soluble incrementar la tr anscripción de una RNP? 2 .4 Nuevo modelo de transcripción viral 2 .5 El nuevo modelo de transcripción en cis en el c ontexto de la infección viral CONCLUSIONES 105 BIBLIOGRAFÍA 109 ANEXO 131