Estudio del desensamblaje in vitro y análisis estructura-función de cavidades de la cápsida del virus diminuto del ratón

Resumen

Las cápsidas de virus esféricos son grandes proteínas multiméricas y constituyen un modelo atractivo para el estudio de la asociación, estabilidad y desensamblaje de proteínas complejas. Además, proporcionan una oportunidad para entender la relación estructura-función de las partículas virales, y en último término, facilitan el desarrollo de vacunas más estables y de nuevas estrategias antivirales basadas en la inhibición del ensamblaje o la desencapsidación. En la presente tesis doctoral hemos analizado el desensamblaje de la cápsida de MVM in vitro y hemos llevado a cabo un análisis estructura-función del papel de cavidades y una carga enterrada situada en el núcleo hidrofóbico de cada subunidad de la cápsida en el ensamblaje y estabilidad de la cápsida, y en la funcionalidad del virus. Los resultados específicos obtenidos se pueden resumir de la siguiente manera: 1. Los análisis biofísicos y bioquímicos del desensamblaje de la cápsida de MVM realizados in vitro han revelado una ruta compleja que puede implicar varias etapas: un reordenamiento conformacional reversible, asociado pero no limitado a la externalización del extremo N-terminal de un número de subunidades de la cápsida; la disociación irreversible de la cápsida en un intermediario; y la disociación/desnaturalización de este en una forma del monómero con estructura similar a la de un glóbulo fundido. 2. La determinación de la fluorescencia intrínseca de los triptófanos de la temperatura de transición del paso específico de disociación de la cápsida se ha validado como procedimiento fiable y preciso para analizar el efecto de mutaciones o condiciones en la estabilidad relativa de la cápsida de MVM frente a la disociación por calor. 3. La inserción de epítopos heterólogos en cuatro bucles expuestos al disolvente de la superficie de la cápsida de MVM, a pesar de encontrarse en los sitios presumiblemente más permisivos de la c