Aproximaciones -ómicas al estudio de la germinación de semillas de especies recalcitrantes: el caso de la encina (Quercus ilex subsp. ballota)

Resumen

La presente Tesis Doctoral está centrada en el estudio de la encina (Quercus ilex L. subsp. ballota [Desf.] Samp.), una especie dominante en los sistemas silvopastorales mediterráneos. El mantenimiento y la sostenibilidad de los bosques de encina se enfrenta actualmente con problemas y retos mayormente relacionados con la conservación de semillas viables, ya que se trata de una semilla recalcitrante, y con la alta tasa de mortalidad de los individuos adultos y plantones luego de ser trasplantados a campo, resultado de las adversas condiciones ambientales. En el presente trabajo se llevó a cabo el estudio de la germinación de semillas de encina, así como de plántulas en estadio temprano mediante una aproximación multidisciplinar que combina las técnicas clásicas de biología molecular con las “ómicas”. Con este objetivo general fueron propuestos los siguientes objetivos específicos 1. Realizar un análisis transcripcional de un grupo de genes candidatos implicados en tolerancia a la de desecación, regulación de la señalización de ABA, metabolismo y defensa contra el estrés oxidativo, a lo largo del proceso de germinación. 2. Identificar genes de expresión diferencial en semilla germinada y de plántulas muy jóvenes de Q. ilex mediante el uso de hibridación sustractiva por supresión (SSH). 3. Identificar proteínas cuya abundancia se ve alterada durante la germinación y desarrollo de plántulas en estadios tempranos, determinando los perfiles proteómicos mediante aproximaciones basadas y libres de gel. 4. Identificar el phosphoproteoma y los cambios que ocurren durante la germinación de semillas Los resultados del análisis transcripcional del grupo de genes candidatos revelaron que las semillas maduras de Q. ilex presentan algunas características fisiológicas intracelulares propias de las semillas ortodoxas que incluyen (i) acumulación de azúcares (sacarosa) y proteínas protectoras (DHN3) y (ii) acumulación de transcriptos implicados en la síntesis de oligosacáridos osmorreguladores de rafinosa (GolS) y en la defensa contra el estrés oxidativo (Sod1, Gst). Sin embargo, las semillas maduras de Q. ilex, como otras semillas recalcitrantes se dispersan con un alto contenido de agua y mantienen el metabolismo parcialmente activo. Los resultados de este análisis transcripcional fueron verificados y complementados con la determinación de (i) niveles de fitohormonas (ABA, GA3, GA4, IAA, iP and iPR), (ii) acumulación de azúcares (Sac, Glc, Fru) y (iii) determinación de proteínas mediante inmunodetección (DHN3, GAPDH, RBCL) y actividad enzimática (SOD); estos resultados mostraron una buena correlación con los transcriptos analizados. El análisis de expresión diferencial de genes mediante SSH permitió identificar por primera vez en Q. ilex un grupo de ESTs correspondiente a genes diferencialmente expresados en semillas germinadas y plántulas en desarrollo temprano. En las semillas germinadas se identificaron 31 genes sobre-expresados, entre los que se incluyen genes que codifican para proteínas implicadas en la respuesta a estreses, transporte, defensa contra estrés oxidativo, modificación de la pared celular, ciclo celular, metabolismo de proteínas y transducción. Por otro lado, 39 transcriptos no redundantes se encontraron sobre-expresados en estadio temprano de plántulas. Las proteínas codificadas por estos transcritos fueron agrupadas en siete categorías funcionales que incluyen fotosíntesis, metabolismo secundario, transporte, señalización, respuesta a diversos estreses, expresión génica y organización de componentes...