Caracterización de genes implicados en la biosíntesis de los azúcares del macrólido oleandomicina y su aplicación en la generación de azúcares

Résumé

En la presente tesis se describe la secuenciación y caracterización de los genes oleV, oleW, oleL, oleS, oleE y oleU, demostrándose su implicación en la biosíntesis de dTDP-L-olivosa mediante la generación de los plásmidos pOLV y pOLE. Este último plásmido incluida el gen oleY. Tras sobreexpresar dicho gen, se hicieron ensayos de actividad frente a distintos sustratos, concluyendo que la metiltransfersas OleY actúa sobre el azúcar unido al aglicón.Este enzima ha sido purificado y caracterizado, concluyendo que actúa a un rango de pH restringido, que su forma nativa es dimérica,que requiere cationes para su buen funcionamiento y que es capaz de metilar L-micarosil-eritronólido B y L-ramnosil-eritronólido B. Los plásmidos pOLV y pOLE fueron introducios en una cepa de S. Lividans que incluía el cósmido cos16F4, obteniéndose los compuestos híbridos: L-olivosil-8-demetil-tetracenomicina C, L-oleandrosil-8-demetil-etracenomicina C, 2'-demetoxi-eloramicina y eloramicina. La obtención del último compuesto nos llevó a concluír que con los genes de biosíntesis de L-olivosa se podía generar el azúcar L-ramnosa, y para confirmarlo se constryó el plásmido pRHAM. Por útlimo en el trabajo se ha construído un plásmido de cassettes pLN2 utilizando los genes de biosíntesis de L-oleandrosa. Este plásmido era capaz de generar 2,6 y 6 deoxiazúcares mediante intercambio, deleción y adición de genes pertenecientes a otros rutas de biosíntesis. En el trabajo se muestra la utilidad del plásmido para intercambiar genes pertenecientes a otras rutas de biosíntesis. En el trabajo se muestra la utilidad del plásmido para intercambiar genes codificadores de 4-cet-reductasas y la generación de un plásmido capaz de sintetizar dTDP-L-rodinosa.