Biosíntesis de mitramicina por streptomyces argillaceuscaracterización de genes implicados en la metilación de la estructura policetídica

Résumé

La mitramicina es un policétido aromático con actividad antibiótica y antitumoral sintetizado entre otras especies por Streptomyces argillaceus. En la estructura de la mitramicina existen tres grupos metilo que son transferidos durante su síntesis por metiltransferasas. Dos de dichos grupos están unidos a la estructura policetídica en posición 1' y 7. El objetivo de este trabajo fue la caracterización genética y funcional de los genes implicados en las dos metilaciones de la estructura policetídica de la mitramicina. Para ello se han estudiado dos regiones separadas de la ruta de biosíntesis denominadas zona I y zona II. En la zona I el análisis de la secuencia obtenida mostró la existencia de tres pautas de lectura abierta denominadas mtmZ, mtmA y mtmR. MtmZ, en base a las homologías con otras proteínas de las bases de datos podría ser una tioesterasa implicada en la separación de la cadena policetídica del complejo enzimático de la PCS una vez finalizada la síntesis. MtmA es una proteína con dos dominios funcionales: S-adenosilmetionina sintetasa y N5, N10-metilentetrahidrofolato reductasa. MtmH mostró similitud con S-adenosil homocisteína hidrolasas. Estos enzimas en el metabolismo primario participan en el ciclo de metilos activados, relacionados con la síntesis de metionina. Los genes mtmA y mtmH se inactivaron conjuntamente mediante reemplazamiento génico. En el mutante generado se sigue produciendo mitramicina lo cual indicó que los genes inactivados no son imprescindibles para la biosíntesis del antibiótico, sin embargo los niveles de producción de mitramicina en la cepa mutante son muy superiores lo cual sugiere un papel regulador de uno o ambos genes en la biosíntesis de mitramicina. En la zona II el análisis de la secuencia indicó la existencia de dos fases de lectura abierta completas denominadas mtmMI y mtmMII. La comparación de ambas proteínas en las bases de datos mostró similitud con metiltransferasas implicadas en la metilación de la estructura policetídica de diversos antibióticos. La inactivación independiente de ambos genes mediante reemplazamiento génico y el ensayo in vitro de la actividad de ambos enzimas demostraron su implicación en las metilaciones de la estructura policetídica de la mitramicina. MtmMI cataliza la, metilación en la posición 4 del intermediario 4-demetilpremitramicinona para formar premitramicinona. MtmMII es la metiltransferasa responsable de la metilación de la posición 9 del intermediario 9-demetilpremitramicina A3 para originar premitramicina A3. A partir del mutante afectado en mtmMII se han aislado y caracterizado dos nuevos compuestos: 7-demetilmitramicina y 9-demetil premitramicina A3.