Transformación genética de alcornoque (quercus suber l.)

Abstract

Se presenta un sistema de transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens para embriones somáticos de alcornoque (Quercus suber L.) maduro seleccionado. Se han estudiado los parámetros que influyen en la eficiencia de transformación, hallándose que: la kanamicina a una concentración de 100 mg·L-1 es un agente selectivo adecuado, mientras que el glufosinato amónico (en su forma comercial Finale(r)) no lo es; a pesar de obtenerse quimeras, el cultivo de éstas durante al menos 3 meses en presencia de 100 mg·L-1 de kanamicina permite obtener embriones homogéneos. De las tres cepas de A. tumefaciens ensayadas (AGL1, LBA4404 y EHA105), AGL1 es la más eficiente. De las combinaciones de densidad de inóculo (A600nm = 0,25, 0,5 ó 1) y tiempo de cocultivo (2 ó 3 días) ensayadas, la óptima es A600nm = 1 y 2 días de cocultivo. En relación al tipo de explanto inoculado, los agregados embriogénicos proporcionan mayor eficiencia de transformación que los embriones aislados; además, los explantos inoculados tras 20 días de subcultivo proporcionan el rendimiento más alto. La luz durante el cocultivo afecta a la eficiencia de transformación, que es mayor cuando los explantos se cocultivan con luz o fotoperíodo que en oscuridad; por el contrario, la temperatura durante el cocultivo no influye significativamente entre 22-26 ºC. Finalmente, la utilización del mutante virGN54D no incrementa significativamente la eficiencia de AGL1. Se han obtenido líneas embriogénicas transgénicas tras la inoculación de diferentes clones con AGL1 pBINUbiGUSint, pBinUbiBar y pBIN19-p35SsGFP. Los dos factores que influyen decisivamente en la eficiencia de transformación son la elección de cepa de Agrobacterium (AGL1) y el momento de recolección de los explantos para su inoculación (20 días después del último subcultivo). Una vez aplicado el protocolo de transformación optimizado se ha obtenido una eficiencia de transformación (i.e.