Aplicación de métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa a la detección y tipificación de bacterias patógenas

Résumé

Esta Tesis se ha centrado en el desarrollo, optimización y aplicación de técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección y caracterización de bacterias patógenas humanas y animales. Se presentan dos métodos de detección, el primero es un sistema de PCR múltiple que permite la detección simultánea de tres de los patógenos más relevantes en la acuicultura continental: Aeromonas salmonicida, Yersinia ruckeri y Flavobacterium psychrophilum. El segundo es un sistema de TaqMan PCR para detectar F. Psychrphilum. En este tipo de PCR, la visualización de los amplicones se realizó midiendo la fluorescencia emitida durante la reacción, de manera que se ahorra tiempo y se evita utilizar sustancias tóxicas como el bromuro de etidio. Estos dos protocolos fueron validados en el diagnóstico de brotes infecciosos ocurridos en diferentes piscifactorías del Principado de Asturias. Para la detección de Salmonella en muestras de origen animal se evaluaron los siguientes parámetros: i) dos protocolos para concentrar el número de células patógenas presentes en al muestra (centrifugación a 13.000 rpm y separación inmunomagnética, IMS); ii) diez sets de iniciadores; y iii) diferentes condiciones de la reacción de amplificación. El protocolo de IMS-PCR utilizando los iniciadores stn fue seleccionado para el trabajo de campo. De las 117 muestras analizadas, 38.5% fueron positivas para Salmonella mediante IMS-cultivo y 36.6% por IMS-PCR. Variantes de métodos de PCR se aplicaron a la caracterización de las cepas de Salmonella aisladas en el trabajo de campo: amplificación de secuencias aleatorias de ADN o RAPD, PCR-ribotipificación, perfil de genes de virulencia y perfil de genes de resistencia. Son técnicas eficaces y rápidas; en ellas pueden utilizarse directamente alicuotas de cultivo como ADN molde; los resultados obtenidos son de fácil interpretación; y se utiliza el mismo equipamiento b