Aplicación de procesos enzimáticos en flujo continuo para la preparación de nucleósidos. Síntesis de oligonucleótidos

Resumen

Los análogos de nucleósido están recibiendo gran atención en Química Médica debido al descubrimiento de sus propiedades biológicas, que los convierten en importantes agentes antivirales y antitumorales. Por otro lado, son las unidades estructurales de los oligonucleótidos antisense y siRNA, desarrollados en los últimos años para inhibir la expresión de un gen que causa una determinada enfermedad. Así pues, los fármacos basados en oligonucleótidos constituyen un área importante para el desarrollo de la industria farmacéutica. Esta Memoria, estructurada en cuatro capítulos, se centra en el uso de la biocatálisis para la preparación de nucleósidos modificados a través de un proceso enzimático en flujo continuo, derivados no naturales de alcaloides muscarínicos, 1’-homo-N-α-nucleósidos y análogos de timina como monómeros precursores de oligonucleótidos. En el primer capítulo, se ha optimizado un proceso enzimático para la levulinilación regioselectiva de los grupos hidroxilo situados en las posiciones 3’ o 5’ en 2’-desoxinucleósidos utilizando las lipasas inmovilizadas de Pseudomonas cepacia y Candida antarctica de tipo B. Se observa que el grupo protector de la nucleobase influye en el resultado de la reacción. Además, se ha desarrollado un proceso en flujo continuo como alternativa al método convencional para llevar a cabo la síntesis a gran escala. Los resultados se encuentran publicados en: “Process Development of Biocatalytic Regioselective 5′‑O‑Levulinylation of 2′-Deoxynucleosides”. A. Carnero, Y. S. Sanghvi, V. Gotor, S. Fernández, M. Ferrero. Org. Process Res. Dev. 2015, 19, 701-709. En el segundo capítulo se desarrolla una síntesis eficiente de la (–)-muscarina y (+)-allo-muscarina, empleando una estrategia quimioenzimática, a partir de un ciano-azúcar fácilmente accesible a gran escala. La etapa clave es una hidrólisis enzimática selectiva mediada por la lipasa de Pseudomonas cepacia inmovilizada. Los resultados se encuentran recogidos en la siguiente publicación: “Short and efficient chemoenzymatic syntheses of non-natural (–)-muscarine and (+)-allo-muscarine from cyano-sugar precursors catalyzed by immobilized Burkholderia cepacia lipase”. A. Carnero, Y. S. Sanghvi, V. Gotor, S. Fernández, M. Ferrero. Adv. Synth. Catal. 2017, 359, 130-137. En el tercer capítulo, se sintetizan varios análogos de 1’-homo-N-α-nucleósidos como potenciales agentes antivirales y antitumorales, mediante una estrategia de acoplamiento de la nucleobase con un azúcar tosilado. Estos importantes monómeros se utilizarán como precursores clave en la preparación de oligonucleótidos. Se está preparando una próxima publicación. El cuarto capítulo describe la síntesis y propiedades de un nuevo derivado de timina que presenta una elongación entre la base y el fragmento de 2’-desoxirribosa. Se han incorporado los derivados succinil y fosforamiditos correspondientes en sitios predeterminados de oligonucleótidos empleando una estrategia de síntesis en fase sólida. Los resultados se han recogido en la siguiente publicación: “The impact of an extended nucleobase-2’-deoxyribose linker in the biophysical and biological properties of oligonucleotides”. A. Carnero, S Pérez-Rentero, A. Alagia, A. Aviñó, Y. S. Sanghvi, S. Fernández, M. Ferrero, R. Eritja. RSC Adv. 2017, 7, 9579-9586. SUMMARY Modified nucleosides have attracted much attention in Medicinal Chemistry since the discovery of their biological properties as antiviral and anticancer agents. On the other hand, they are the structural units of antisense oligonucleotides and siRNA, molecules able to block disease process by altering the synthesis of a particular protein. Thus, oligonucleotide-based therapeutic products are already playing a major role in the pharmaceutical industry. This Doctoral Dissertation, divided in four different chapters, is focused in the use of biocatalysis to prepare modified nucleosides through enzymatic continuous flow processes, non-natural derivatives of muscarine alkaloids, 1’-homo-N-α-nucleosides, and thymine analogues as building blocks for the construction of oligonucleotides. In the first chapter, an enzymatic process has been optimized for regioselective levulinylation of the 3’- or 5′-hydroxyl group in 2′-deoxynucleosides using Pseudomonas cepacia and Candida antarctica type B immobilized lipases. The nucleobase protecting group influenced the successful outcome of the enzymatic reaction. Furthermore, a continuous flow protocol as a superior alternative to batch process has been developed, particularly when scale-up is required. The results obtained were published in: “Process Development of Biocatalytic Regioselective 5′-O-Levulinylation of 2′-Deoxynucleosides”. A. Carnero, Y. S. Sanghvi, V. Gotor, S. Fernández, M. Ferrero. Org. Process Res. Dev. 2015, 19, 701-709. The second chapter describes the efficient preparation of enantiopure (2R)-configured non-natural (–)-muscarine and (+)-allo-muscarine by a chemoenzymatic approach from an easily accessible cyano-sugar available on a large-scale. The key selective enzymatic hydrolysis step has been accomplished by immobilized Pseudomonas cepacia lipase. The results have been published in: “Short and efficient chemoenzymatic syntheses of non-natural (–)-muscarine and (+)-allo-muscarine from cyano-sugar precursors catalyzed by immobilized Burkholderia cepacia lipase”. A. Carnero, Y. S. Sanghvi, V. Gotor, S. Fernández, M. Ferrero. Adv. Synth. Catal. 2017, 359, 130-137. In the third chapter, several new 1’-homo-N-α-nucleoside analogues as potential antiviral or antitumor compounds have been synthesized via coupling of a nucleobase and a tosylated intermediate sugar precursor. These important monomers will be use as building-blocks to prepare oligonucleotides. A paper is under preparation. The fourth chapter describes the synthesis and properties of a novel thymine derivative containing an extended linker between the thymine nucleobase and the 2’-deoxyribose moiety. Corresponding phosphoramidite and succinyl derivatives have also been incorporated into oligonucleotides at predetermined sites and defined internucleotidic motifs using the solid-phase synthesis approach. The results obtained were published in: “The impact of an extended nucleobase-2’-deoxyribose linker in the biophysical and biological properties of oligonucleotides”. A. Carnero, S Pérez-Rentero, A. Alagia, A. Aviñó, Y. S. Sanghvi, S. Fernández, M. Ferrero, R. Eritja. RSC Adv. 2017, 7, 9579-9586.