El empleo de metalo-fármacos como potenciales agentes antitumoralesestudios de incorporación y reactividad en modelos celulares

Resumen

El cisplatino es un fármaco que se emplea para el tratamiento de una gran variedad de tumores sólidos, entre los que se encuentran el cáncer de ovario, de vejiga, o de pulmón, siendo especialmente eficaz para el tratamiento del cáncer de testículo. Sin embargo, presenta una elevada toxicidad y problemas de resistencia, tanto intrínseca como adquirida, que se presenta en el 50% de los pacientes. Se estima, en este sentido, que la resistencia a la quimioterapia es la causa de más del 90% de las muertes por cáncer. Aún no se conocen con detalle los mecanismos que dan lugar a esta resistencia, pero se sabe que son complejos y multifactoriales, por lo que se hace necesario el desarrollo de metodologías que permitan ampliar los conocimientos científicos de las causas que llevan a esta resistencia. Asimismo, el desarrollo de nuevos fármacos que, manteniendo la eficacia del cisplatino, limiten su toxicidad y las resistencias es de gran importancia, junto con metodologías analíticas que permitan estudiar las respuestas a estos tratamientos a nivel celular. Por todo ello, el objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido el de desarrollar metodologías analíticas para estudiar las interacciones de metalofármacos con biomoléculas en cultivos celulares, utilizando para ello como herramienta principal el ICP-MS en combinación con diferentes técnicas analíticas que permitan estudiar estas interacciones a distintos niveles. Los estudios desarrollados se han centrado en el estudio comparativo del grado de incorporación celular del cisplatino y dos análogos, el oxaliplatino y el Pyrodach-2, este último en estudios clínicos, así como la determinación estructural de los aductos que forman con el ADN mediante técnicas de espectrometría de masas molecular. Un estudio similar, se llevó a cabo para estudiar las interacciones con el ADN de varios complejos de rutenio que podrían tener un modo de acción similar. Además, la incorporación del cisplatino no solo se estudió de forma global, sino que se desarrollaron diferentes estrategias para estudiar el contenido de Pt en cada célula individual. Para ello, las células se introdujeron en el sistema de ICP-MS mediante nebulización neumática, pero también se exploraron metodologías como la ablación láser y la generación de microgotas para este fin. Finalmente, se estudió la formación de aductos de forma más específica en las regiones teloméricas de los cromosomas, y se propuso una metodología para cuantificar la enzima telomerasa, encargada de su alargamiento y cuya actividad se ve influida, probablemente, por la presencia de aductos de cisplatino en los telómeros. A continuación, se resumen los resultados más importantes de estos estudios: - Se ha desarrollado un sistema de análisis por inyección en flujo basado en ICP-MS para la cuantificación de la concentración global de un metalofármaco en cultivos celulares referido al peso total de células secas que ha permitido comparar la incorporación celular de los fármacos de Pt estudiados. Asimismo, el empleo de técnicas híbridas de cromatografía de líquidos con ICP-MS y técnicas de espectrometría de masas moleculares han permitido dilucidar las estructuras de los aductos formados por los fármacos de platino y los potenciales fármacos de rutenio con el ADN. - Se ha puesto a punto y caracterizado un sistema de introducción de muestra mediante nebulización neumática para el análisis individual de células tumorales tratadas con cisplatino, que se ha aplicado también a levaduras enriquecidas en selenio, obteniendo mejores eficiencias para la introducción de células que muchos estudios publicados. - Se ha estudiado, de forma preliminar, otros sistemas de introducción de células individuales, mediante ablación láser y generación de microgotas. Para la primera técnica, se han resuelto algunos problemas relacionados con la contaminación y se ha concluído que la técnica del barrido superficial podría ser la más adecuada si se pueden encontrar las condiciones de estandarización necesarias. En cuanto a la generación de microgotas, se ha obtenido el límite de detección potencial de Pt en células individuales, pero la caracterización no se ha podido llevar a cabo completamente. - Se ha aplicado, asimismo, la técnica de LA-ICP-MS para realizar un mapeo de la distribución del Pt en una célula tumoral tratada con cisplatino. Se han obtenido imágenes de varias células mediante esta técnica. \item Se ha desarrollado un método que permite aislar las regiones teloméricas a partir de muestras de ADN genómico de cultivos celulares, con lo que se ha podido cuantificar la cantidad de Pt unida al ADN telomérico. - Finalmente, se ha puesto a punto una estrategia de marcaje metálico con el reactivo MeCAT-IA de un oligonucleótido de ADN para sintetizar una sonda de hibridación que permita cuantificar la enzima telomerasa mediante una metodología que combina su purificación mediante inmunoprecipitación con su cuantificación mediante ICP-MS a través del metal de la sonda de hibridación. Un cambio forzoso en el anticuerpo no ha permitido una caracterización completa de la estrategia, aunque se muestra como una estrategia prometedora alternativa al ELISA tradicional que permitiría cuantificar únicamente la fracción activa de la enzima.