Avances en la cuantificación absoluta de proteínas intactas sin patrones específicos mediante espectrometría de masas elemental

Résumé

La determinación de niveles o cantidades absolutas de una biomolécula de interés es uno de los principales desafíos en las diferentes ramas de las ciencias de la vida, debido a que este tipo de información es necesaria para poder entender los diferentes sistemas biológicos, estudiar la toxicidad de determinados compuestos, llevar a cabo el descubrimiento de nuevos biomarcadores, o incluso la caracterización de patrones que serán empleados para diferentes aplicaciones cuantitativas. En este sentido, los recientes avances en cromatografía y espectrometría de masas elemental (ICP-MS) han establecido al ICP-MS como alternativa real para la cuantificación absoluta de proteínas a través de los heteroátomos presentes en las mismas. Concretamente, la inclusión de analizadores tipo cuadrupolo en tándem (MS/MS) ha permitido el análisis altamente sensible y libre de interferencias de elementos clave en proteómica, como el azufre o el fósforo. Todo esto ha resultado en la posibilidad de llevar a cabo la cuantificación de péptidos/proteínas que contengan dichos elementos sin necesidad de patrones específicos mediante el empleo de estrategias específicas como la dilución isotópica post-columna. No obstante, las limitaciones instrumentales todavía existentes, mayoritariamente referentes a la separación previa al ICP-MS, han supuesto un impedimento para poder extender este tipo de análisis al estudio de proteínas intactas y grandes biomoléculas. A lo largo de la presente Tesis Doctoral se ha abordado el desarrollo de técnicas y metodologías para poder cuantificar de forma absoluta proteínas intactas -e incluso algunas de sus modificaciones post-transduccionales-, y otras biomoléculas de interés, sin patrones específicos, a través de la medida mediante ICP-MS de elementos presentes en su estructura química. En el primer capítulo se ha llevado a cabo el desarrollo de una metodología analítica para la cuantificación absoluta de proteínas intactas mediante cromatografía de líquidos acoplada a ICP-MS, a través de la medida del azufre, presente en todas las proteínas, empleando dilución isotópica en línea y patrones genéricos. Para ello, se han evaluado diferentes tipos y condiciones cromatográficas, a fin de obtener condiciones óptimas que permitieran el análisis de proteínas intactas con recuperación cromatográfica cuantitativa y buena resolución. Una vez logradas las condiciones óptimas, se ha llevado a cabo la cuantificación absoluta de patrones de proteínas, demostrando la aplicabilidad de la metodología incluso en mezclas sencillas de proteínas. En el segundo capítulo se ha evaluado la aplicación de la metodología desarrollada en el primer capítulo, para llevar a cabo la cuantificación de las diferentes proteínas y proteoformas presentes en muestras reales de venenos de serpientes africanas. El estudio se ha llevado a cabo mediante la combinación de los resultados cuantitativos obtenidos a través de la detección cuantitativa de azufre por ICP-MS, junto con la identificación de las diferentes especies proteicas presentes en el veneno mediante espectrometría de masas molecular con fuente de electrospray (ESI-MS). Las muestras evaluadas habían sido previamente caracterizadas mediante estrategias proteómicas establecidas, con lo que ha sido posible llevar a cabo la validación de la metodología propuesta y una comparación crítica. En el tercer capítulo se ha desarrollado una aproximación cuantitativa innovadora para poder llevar a cabo el análisis cuantitativo simultáneo, y bajo las mismas condiciones, del azufre y de otros elementos de interés para el análisis de biomoléculas, como el fósforo, el arsénico, el selenio, el bromo, o el yodo. Para ello se ha desarrollado una estrategia basada en la adición controlada de metano gas al plasma, para corregir los cambios de sensibilidad elemental que tienen lugar en los gradientes cromatográficos. Esto ha permitido cuantificar todos los elementos previamente mencionados sin requerir la adición post-columna de ningún reactivo, incluidos trazadores isotópicos (dilución isotópica post-columna). En el cuarto capítulo se han evaluado y comparado el metano y el dióxido de carbono, y se ha evaluado la validez y aplicabilidad de la metodología para la cuantificación absoluta y simultánea de biomoléculas con patrones genéricos (proteínas, fosfoproteínas, iodoproteínas, metabolitos de selenio y bromo).