Ácidos nucleicos estructurados como receptores de afinidad para el diseño de sensores electroquímicos

Resumo

En esta Tesis Doctoral, se exploran diferentes esquemas de integración de ácidos nucleicos estructurados con transductores electroquímicos para la determinación de moléculas de naturaleza no nucleotídica, tanto de pequeño tamaño molecular o haptenos, como proteínas. Como modelo de hapteno se ha utilizado el antibiótico aminoglicósido tobramicina, para cuya determinación se han desarrollado y evaluado dos estrategias generales de ensayo, basadas en el empleo de aptámeros de ARN modificados como receptor de afinidad. En primer lugar, se ha demostrado que la modificación del aptámero de ARN natural, mediante la introducción de grupos OMe en la posición 2¿ de los anillos de ribosa, conduce a una pequeña disminución en la afinidad del mismo hacia la tobramicina, medida por espectroscopia de resonancia de plasmón de superficie (SPR). Sin embargo esta modificación, que aumenta la resistencia del receptor a la degradación por nucleasas, no imposibilita la utilización de los aptámeros como elementos de reconocimiento en ambos ensayos. El primero es un sensor impedimétrico que no requiere el empleo de reactivos marcados y utiliza un formato de ensayo de desplazamiento. El sensor se construye inmovilizando el aptámero mediante enlace de afinidad a una superficie de oro modificada con tobramicina, puede ser fácilmente regenerado y presenta excelentes características analíticas, tanto en términos de sensibilidad como de selectividad. Se ha demostrado que este sensor puede utilizarse para medir tobramicina en muestras de suero humano tras una mínima dilución (1 a 1,5) de las mismas. En esta matriz presenta un límite de detección de 1,8 µM y un intervalo dinámico lineal entre 3 y 70 µM, que cubre el intervalo terapéutico del antibiótico. En segundo lugar, se utilizó el mismo aptámero pero marcado con biotina o fluoresceína para desarrollar un ensayo voltamétrico utilizando micropartículas magnéticas como plataforma sensora. Una vez que se ha producido el proceso de reconocimiento sobre las micropartículas en un formato de ensayo de inhibición, se detecta la cantidad de aptámero marcado mediante la incorporación de la enzima fosfatasa alcalina (ALP). La señal analítica se obtiene utilizando electrodos serigrafiados de carbono sobre los que se fijan con la ayuda de un imán las micropartículas modificadas, midiendo la actividad enzimática enlazada por voltametría diferencial de pulso tras la adición del sustrato de la enzima, ¿-naftilfosfato. Se han evaluado comparativamente dos sistemas diferentes para incorporar la enzima, uno multivalente (biotina-estreptavidina) y el otro monovalente (fluoresceína- antifluoresceína fragmento Fab). El sistema monovalente de marcaje permite obtener un intervalo lineal de respuesta más amplio y un menor límite de detección, además de aportar una mayor reproducibilidad al dispositivo. Este ensayo permite determinar tobramicina en suero humano con un límite de detección 1 µM y un intervalo lineal entre 1 y 200 µM. Para la detección de proteínas, se tomó como modelo los anticuerpos correspondientes a FLAG y a uno de los epítopos del virus VIH, para los que no se han descrito aptámeros. Se exploró la viabilidad de un nuevo concepto de sensor, denominado ¿scaffold sensor¿, para determinar estas proteínas en suero. Aunque el sensor propuesto genera una señal analítica en presencia del anticuerpo en suero, son necesarias investigaciones adicionales para mejorar su comportamiento en esta matriz compleja.