Regulación de la actividad de las células ganglionares melanopsínicas en la retina del ratón (Mus Musculus)Desarrollo de software para su análisis

Resumen

Los seres vivos han evolucionado adaptándose a los cambios ambientales cíclicos, para lo que han desarrollado ritmos fisiológicos que preparan el organismo para tales cambios. Los más estudiados son los circadianos (con un periodo de alrededor de un día) y se manifiestan en ciclos de actividad/reposo, que se sincronizan con los ciclos externos de 24 horas, principalmente por la señal lumínica transmitida a través de las células ganglionares intrínsecamente fotosensibles de la retina (ipRGC). Las ipRGC integran las señales que reciben de conos y bastones con la que ellas mismas generan al captar la luz mediante el fotopigmento melanopsina, enviándola al núcleo supraquiasmático (SCN), el reloj biológico principal. Entre las ipRGC existen subpoblaciones celulares que se definen por la cantidad de melanopsina que expresan, el tamaño de su soma, la localización de sus dendritas, así como por la expresión de las dos isoformas de la melanopsina y por su regulación. En esta tesis doctoral se han desarrollado métodos de registro y medida de la actividad animal basados en vídeo que, combinados con diversas condiciones experimentales, permiten deducir características del funcionamiento de las ipRGC y del SCN. Los resultados obtenidos evidencian que la ausencia de conos y bastones en ratones con degeneración retiniana rd podría afectar al desarrollo del SCN. Asimismo, se ha observado que el tiempo de postefectos (demora en manifestar el ritmo endógeno) aumenta con la diferencia entre el periodo endógeno del animal y el fotoperiodo ambiental previo. Se ha puesto de manifiesto igualmente la capacidad de la melanopsina para regenerar su propio sustrato, al observarse que en ratones rd la luz azul provoca una modificación progresiva del patrón circadiano. Además, mediante la deleción dirigida de células dopaminérgicas en la retina se ha observado un retraso en su actividad bajo condiciones normales de iluminación, lo cual refuerza la idea de un rol crucial de la dopamina en la fisiología de la retina y, en particular, de las ipRGC. Por otro lado, con el propósito de objetivar las observaciones al microscopio se han construido herramientas informáticas para el estudio avanzado de las preparaciones histológicas. Se ha desarrollado software para la fusión de imágenes obtenidas manualmente en 3 dimensiones en un microscopio de campo claro y para la fusión por capas celulares de imágenes procedentes de un microscopio confocal. También se ha creado un programa para la detección y medida automatizada de células mediante la combinación de técnicas de análisis de imagen, inteligencia artificial y arquitectura de software. Todo este conjunto de herramientas se ha utilizado para medir la cantidad de fotopigmento en más de 10000 ipRGC, cuantificándose el inmunomarcaje, en unos casos, de la melanopsina total y, en otros, de sus isoformas. El análisis de los datos, empleando técnicas de Data Mining, ha permitido describir varias subpoblaciones celulares en función del diámetro de su soma y de la intensidad de inmunomarcaje, que fueron posteriormente confirmadas mediante la observación de las dendritas de células de cada una de ellas. Se ha creado un modelo probabilístico de clasificación sin precedentes para categorizar los tipos de ipRGC en función de los parámetros mencionados. Este modelo ha permitido cuantificar la expresión in vivo e in vitro (en cultivo organotípico de retina) de cada tipo celular en diferentes momentos circadianos y combinaciones de iluminación. Nuestros resultados muestran la existencia de un gran grupo de ipRGC no descrito previamente, así como de subpoblaciones con diversa regulación dentro los tipos de ipRGC. Estas herramientas informáticas, desarrolladas para atender el propósito de la investigación presentada en esta tesis, además de haber sido fundamentales para la obtención de los resultados de la misma, por su carácter innovador y su amplia aplicabilidad, pueden revelarse de gran utilidad en otros campos de investigación.