Desarrollo de nuevas metodologías analíticas para el estudio de fármacos antirretrovirales e inhibidores de la resorción ósea

Resumen

En la actualidad la medicina y la salud, y por ende los medicamentos, constituyen uno de los principales puntos de interés de la sociedad. Un medicamento es un producto de alto valor añadido fruto de procesos de investigación, desarrollo e innovación que ha mejorado la calidad y esperanza de vida. Para que un fármaco pueda salir al mercado se precisa de una fuerte inversión económica que permita llevar a cabo un largo proceso de investigación y estudios clínicos, seguido de un seguimiento de todo el ciclo de vida de estos productos por parte de los laboratorios farmacéuticos y las autoridades sanitarias, con el fin de asegurar la calidad de los fármacos y la vigilancia de su efectividad y reacciones adversas asociadas. Las enfermedades crónicas son enfermedades de larga duración y por lo general de progresión lenta que afectan cada vez a un número mayor de personas. Por lo tanto son uno de los principales problemas de salud de estos tiempos, tanto en países desarrollados como subdesarrollados. En este tipo de enfermedades, los tratamientos a base de medicamentos tan solo sirven para mejorar un problema durante el tiempo que se aplica el tratamiento. Este es el caso de la infección del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el desarrollo del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Hoy en día no existen tratamientos que curen esta afección, en cambio sí que existe una variedad de medicamentos antirretrovirales que ayudan a disminuir la carga viral del VIH hasta niveles indetectables, consiguiendo que esta enfermedad haya pasado de ser considerada letal (en la década de los 80 y principios de los 90) a enfermedad crónica. Otro ejemplo de enfermedades crónicas, que tienen una gran incidencia en la sociedad actual, son aquellas ligadas a los fenómenos de resorción ósea, como son la enfermedad de Paget, el mieloma múltiple, la osteoporosis o la metástasis ósea. En este caso, los bifosfonatos resultan ser el principal medicamento que se administra con el fin de retardar y paliar la pérdida de masa ósea. Pero en muchas ocasiones, los tratamientos a base de medicamentos de enfermedades crónicas no funcionan y debe investigarse cuáles son las razones de que esto suceda. El desarrollo de técnicas instrumentales que permitan el análisis de mezclas de fármacos en preparados farmacéuticos y en muestras biológicas, es de vital importancia, tanto en las fases de investigación de desarrollo del fármaco, como en las posteriores etapas de seguimiento del ciclo de vida del mismo. De este modo se puede estudiar su calidad, el desarrollo de nuevas formulaciones o el grado de eficacia de la adherencia al tratamiento de un paciente. Esto último se hace más necesario en pacientes crónicos, a los cuales se les administra durante un largo periodo de tiempo un mismo medicamento, ya que la eficacia del mismo puede ir variando con el tiempo así como su toxicidad. Por todo ello, la Química Analítica, mediante sus diferentes técnicas de cromatografía y electroforesis, resultan ser una herramienta útil y necesaria que permite cumplir parte de estas necesidades. En este contexto, la presente Tesis Doctoral, se centró en el desarrollo de técnicas analíticas, que permitan de manera más o menos sencilla, separar y cuantificar en plasma humano o en preparados farmacéuticos dos grandes familias de fármacos asociadas a tratamientos de enfermedades crónicas: los antirretrovirales suministrados en enfermos seropositivos y los bifosfonatos. Así, el presente trabajo se ha dividido en tres partes: Desarrollo de métodos de separación y cuantificación de fármacos antirretrovirales basados en la cromatografía de líquidos y detección UV. Se han puesto a punto dos métodos cromatográficos simples, sensibles y específicos basados en una elución en gradiente y una elución isocrática para la separación y cuantificación simultánea de fármacos antirretrovirales diferentes. Para la separación en gradiente, basada en una cromatografía en fase reversa, usando una columna C18 (25 cm x 4.6 mm d.i. y diámetro de tamaño de particular 5 µm) y detección UV, se han separado (en 15 minutos) y cuantificado los siguientes fármacos antirretrovirales: abacavir, nevirapina, efavirenz, tenofovir, indinavir, atazanavir, amprenavir, ritonavir y lopinavir. La fase móvil está compuesta de una mezcla de un tampón de fosfatos (Na2HPO4 7 mmol/L, pH 6.0) y acetonitrilo. El flujo de la fase móvil se fija en 1,5 mL/min. Una vez optimizada la separación se ha encontrado que la linealidad es aceptable para cada compuesto en el intervalo 50 ng/mL – 10000 ng/mL y, que los límites de detección, son adecuados para su cuantificación en plasma. Para el tratamiento de las muestras de plasma se compara una extracción líquido-líquido (basada en el uso de tertbutilmetileter) y una extracción sólido-líquido (SPE) haciendo uso de cartuchos C18. La extracción sólido-líquido mostró ser la mejor opción obteniéndose buenos resultados de recuperación (>80%) y precisión (<15%) en el análisis de muestras de plasma dopadas con todos los fármacos (excepto el tenofovir). En una segunda fase, ante el aumento del uso de otros fármacos pertenecientes a la familia de los inhibidores de la proteasa, y basándose en las condiciones cromatográfica del método de separación anterior, se pone a punto un método de separación cromatográfica isocrática en fase reversa y detección UV que permite el análisis simultáneo en 20 minutos de 10 fármacos antirretrovirales: nevirapina, efavirenz, indinavir, atazanavir, amprenvir, ritonavir, lopinavir, saquinavir, nelfinavir y tipranavir. Nuevamente, una vez optimizadas las condiciones de análisis se obtienen buenos resultados de linealidad en el intervalo 100 ng/mL – 20000 ng/mL (en el caso del tipranavir hasta 50000 ng/mL) y unos límites de detección adecuados para su cuantificación en plasma. Haciendo uso de la SPE se ha calculado la recuperación (>90%) y precisión (<20%) para varios de estos fármacos en muestras de plasma dopado. Por último, aplicando los dos métodos cromatográficos, se analiza una muestra de un paciente seropositivo al que se le suministra Kaletra (lopinavir + ritonavir), además de otros fármacos como son: Orfidal, Seroxat o Videx. Se obtienen para esta muestra resultados acordes a lo esperado, además de constatar que no se muestran interferencias a pesar del número de fármacos que se le administran al paciente. Desarrollo de métodos de separación y cuantificación de fármacos antirretrovirales basados en la electroforesis capilar (CE) y detección UV. En esta etapa, se desarrollan dos separaciones simples y rápidas de electroforesis capilar (MECK) para la determinación de indinavir, ritonavir, saquinair, nelfinavir, lopinavir, amprenavir, darunavir, atazanavir, estavudina, zidovudina, didanosina, nevirapina, efavirenz y raltegravir. Los análisis se realizan en un capilar de 75 µm de diámetro interno y 48.5 cm de longitud (detector situado a 40 cm), siendo la detección a 200 nm. Para uno de los métodos se utiliza un tampón compuesto de SDS 15 mmol/L + 10 mmol/L de tetraborato sódico a pH 9.2 y 30% de acetonitrilo. En el segundo método de separación la composición del tampón es la misma, excepto la proporción de acetonitrilo (5%). Las muestras se inyectaron hidrodinámicamente aplicando 50 mbar durante 6 segundos, y en todos casos todos los fármacos se separan en menos de 10 minutos. En el primer caso el potencial aplicado y la temperatura son 20 kV a 25 ºC y en el segundo 30 kV a 40 ºC. Una vez optimizadas las dos separaciones, se evalúa una de las dos para el análisis de indinavir, nevirapina y raltegravir en muestras de plasma humano dopado. Para ello se utiliza una extracción SPE similar a la empleada en el apartado anterior, encontrándose valores de precisión, recuperación y sensibilidad adecuados. Desarrollo de técnicas de separación acopladas a ICP-MS para la cuantificación de bifosfonatos. La separación y cuantificación de bifosfonatos ha sido siempre un reto para la Química Analítica debido a la ausencia de grupos cromóforos en este tipo de moléculas. Tradicionalmente, los métodos existentes se han decantado por la derivatización de estas moléculas y su posterior detección mediante una técnica espectroscópica. En este trabajo, se demostrará la viabilidad de acoplar de manera sencilla separaciones cromatográficas o electroforéticas a detectores elementales (ICP-MS) que nos permitan la cuantificación de estos fármacos en muestras acuosas monitorizando 31P. En una primera fase se han puesto a punto dos separaciones cromatográficas (una cromatografía de intercambio aniónica y otra de pares iónicos) que permiten separar y cuantificar dos bifosfonatos (alendronato y clodronato) pertenecientes cada uno a las dos familias existentes de estos medicamentos. La cromatografía de intercambio aniónico se realiza con un gradiente de una fase móvil de acetato de amonio pH 4.2 (de 10 mmol/L a 100 mmol/L). La columna utilizada está rellena con un polímero con grupos amonio cuaternario (4.6 x 75 mm, 6 µm de tamaño de partícula). En los pares iónicos la fase móvil está compuesta de una mezcla 10 mmol/L de acetato de amonio pH 4.2 + 1.5 mmol/L de hidrogenosulfato de tetrabutilamonio y de metanol (85/15, v/v). Con ambas separaciones se obtienen buenos resultados de linealidad (intervalo: 5.0 a 80.0 µg/mL) y límites de detección adecuados para el análisis de la pureza de estos fármacos. En ambos casos se ha usado un espectrómetro de masas de alta resolución, Thermo Element 2. En una segunda fase, se han desarrollado estudios preliminares para optimizar la separación y cuantificación del alendronato y clodronato, mediante electroforesis capilar acoplada a un ICP-MS con celda de colisión modelo iCAP-Q. En este caso se han probado diferentes aproximaciones y herramientas que pueden mejorar la detección del fósforo, basadas en la tecnología de la celda de colisión. No obstante, se ha comprobado que se obtienen buenos resultados trabajando en modo estándar. La separación se ha realizado utilizando un tampón de NH4HCO3 4 mmol/L, pH 8.3 y aplicando un voltaje de +30 kV en un capilar de 50.0 cm de longitud total y 75 μm de diámetro interno a 25 ºC. Con estas condiciones se ha comprobado la linealidad en el intervalo 10-100 µg/mL y se han calculado los límites de detección para el alendronato obteniéndose resultados similares a los alcanzados con la cromatografía de líquidos (de intercambio aniónico y pares iónicos) acoplada a un ICP-MS de alta resolución desarrollada previamente.