Contribución a la determinación de las funciones de cro, ant y orf22 del fago A2 sobre la decisión lisis/lisogenia durante la infección de Lactobacillus casei

Resumo

A2 es un bacteriófago atemperado que infecta cepas de Lactobacillus casei y L. paracasei, dos especies utilizadas como iniciadores en la fermentación láctea, que además incluyen cepas probióticas. El interruptor genético que regula la decisión del tipo de ciclo de desarrollo del fago, está compuesto por dos promotores adyacentes de expresión divergente (PL y PR) que gobiernan la síntesis de los represores del ciclo lítico (CI) y del lisogénico (Cro) respectivamente. Adyacentes a cI y a cro existen dos genes (orf22 y ant respectivamente) que se co-transcriben con ellos y que podrían modular el efecto de cada represor. En esta Tesis se han abordado tres temas complementarios: a) la determinación de si cro origina dos proteínas durante el ciclo lítico de A2 como consecuencia del desplazamiento a la pauta -1 de parte de los ribosomas, al igual que ocurre cuando el gen se expresa en Escherichia coli, b) el papel de Orf22 y c) de Ant, en la decisión del tipo de ciclo que seguirá el fago tras la infección. Respecto al primer apartado, hemos observado que cro da lugar únicamente a la proteína canónica, ya que solo se observa una banda reconocible por anticuerpos anti-Cro en experimentos tipo Western y que el ciclo lítico de un profago con una mutación en la secuencia deslizante es indistinguible del llevado a cabo por el de tipo silvestre. La sobreexpresión de Orf22 no tiene ningún efecto fenotípico sobre la infección por A2. Aunque no se puede excluir que pudiera jugar algún papel en condiciones diferentes a las empleadas, éste sería peculiar de A2, ya que no se encuentran secuencias homólogas a orf22 en otros fagos. Prácticamente todos los fagos atemperados de bacterias lácticas presentan versiones del gen ant de A2. Sin embargo, en este fago la proteína que resulta de su expresión, de 160 aminoácidos, carece del tercio carboxi-terminal de sus homólogas. Para estudiar el papel de Ant se obtuvieron tres formas de la misma: la silvestre; la extendida, de 255 aminoácidos (resultante de una mutación en el triplete stop) y la corta, con los 142 residuos aminoterminales. La sobreexpresión de Ant y de Ant-255 provoca un aumento muy significativo de las progenies obtenidas a partir de cultivos infectados e inducidos de L. casei. Ant no se une a otras proteínas implicadas en la decisión del tipo de ciclo ni al ADN del interruptor genético, pero sí al extremo 5¿, no codificante, del ARNm resultante de la expresión de PR. Ant-255se une a este ARNm, pero lo hace con mayor afinidad al segmento de ADN intergénico que alberga a PL y a PR. De los experimentos realizados se deduce que ambas proteínas favorecen la expresión de cro, aunque por mecanismos distintos, coadyuvando así a la labor de Cro de dirigir el desarrollo viral hacia el ciclo lítico.