Selección de aptámeros contra proteínas alergénicas del gluten y su aplicación en ensayos electroquímicos

Resumen

En la presente tesis se aborda el problema de la detección de gluten en alimentos para celíacos, aún no resuelto satisfactoriamente con los inmunoensayos comerciales. Para ello se propone la obtención de receptores no proteicos, concretamente aptámeros, y su empleo en ensayos analíticos que permitan la detección de las proteínas tóxicas. Mediante el procedimiento SELEX y empleando como diana el péptido inmunodominante 33-mer, se obtuvieron varios aptámeros. Su afinidad por el péptido así como por la proteína completa fue evaluada empleando espectroscopia de impedancia farádica, espectrocopia de resonancia de plasmón de superficie y cronoamperometría. Todos ellos mostraron una mayor afinidad por el péptido que por la gliadina, siendo el denominado Gli 4 el de mayor afinidad. Se evaluó también su reactividad hacia otras prolaminas tóxicas. Mientras que Gli 4, Gli 1 y Gli 3 son capaces de enlazarse a las hordeinas de la cebada y las secalinas del centeno, Gli 12 no responde a éste último. El aptámero Gli 4 fue el único capaz de detectar aveninas, cuyo potencial tóxico es controvertido. La selectividad contra proteínas de soja, maíz y arroz, no inmunotóxicas, fue total. Con el fin de comprobar la idoneidad de desarrollar un método electroquímico de detección de gluten en alimentos, inicialmente se transformó un método ELISA óptico comercial en electroquímico, consiguiéndose características de respuesta análogas o ligeramente superiores a las del método existente. Por tanto, se desarrollaron dos métodos competitivos de análisis electroquímicos basados en la inmovilización del péptido 33-mer sobre partículas magnéticas empleando los aptámeros Gli 4 (más afin) y Gli 1 (más abundante). Cuando la calibración se realizó con el patrón recomendado de gliadina, PWG, se obtuvo un límite de detección de 4,9 ppm y 0,5 ppm, respectivamente, en concordancia con la mayor afinidad de Gli 4. Este último es el más bajo obtenido hasta el momento. La reproduciblidad del ensayo para una concentración de 10 ppb es del 8% y 6%, respectivamente. Cuando se empleó 33-mer como patrón, únicamente Gli 1 respondió adecuadamente, por lo que fue el aptámero seleccionado para el análisis de muestras hidrolizadas. Finalmente, ambos ensayos se aplicaron a la detección de gluten tanto en muestras certificadas como de contenido desconocido, obteniendo resultados que correlacionan bien con los certificados o con los obtenidos mediante dos métodos comerciales. No se obtuvieron falsos negativos y los escasos falsos positivos fueron fundamentalmente debidos a la mayor sensibilidad de los métodos aquí descritos