Expresión génica y dinámica de metilación del ADN en procesos de organogénesis adventicia en Pinus radiata D. Don

Resumen

Las coníferas representan más del 50 % de la masa forestal del planeta y en particular en España, el 94,4 % de este área pertenece al género Pinus teniendo a Pinus radiata D. Don como la tercera especie más importante. Debido a que los bosques juegan un papel crucial en el cambio climático, han sido incluidos en el protocolo de Kyoto por su capacidad de acumulación de CO2, considerada incluso mayor que la de la atmósfera. Para incrementar la producción, la multiplicación de genotipos élite a través de la caulogénesis adventicia in vitro a partir de embriones zigóticos, es la técnica más eficaz. Estas técnicas se consideran una posible fuente de variación epigenética que provocan la activación de transposones y modificaciones de genes específicos. La epigenética puede ser entendida como un sistema para regular selectivamente la activación o inactivación de la expresión génica y a nivel molecular la metilación del ADN y las modificaciones post-traduccionales de histonas entre otros factores, cooperan en su conjunto. Teniendo en cuenta estos antecedentes, en este estudio se aborda la regulación epigenética de la organogénesis adventicia inducida por la citoquinina bencil adenina (BA) en embriones zigóticos de Pinus radiata. El papel de la metilación del ADN y la acetilación de la histona H4 como reguladores de la organogénesis adventicia se comparó con otros programas de desarrollo como la rizogénesis adventicia inducida por la acción de la auxina ácido indol-3-butírico (IBA), la formación de tejido indiferenciado (callo) inducida por el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y la inhibición de la germinación por el ácido abscísico (ABA). Mediante una hibridación sustractiva supresora se identificaron diferentes genes relacionados con la caulogénesis adventicia, y se analizó su función biológica y su expresión mediante la hibridación de un dot blot. También se constató mediante una inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP) una regulación mediante metilación del ADN de los genes identificados asociados a calulogénesis y los inducidos en cultivos celulares en presencia del agente demetilante 5-Aza-2-deoxicitidina. Asimismo se identificaron nuevos genes candidatos mediante la hibridación de un dot blot en esta misma situación experimental. Para abordar el estudio de la dinámica global y espacio-temporal de la metilación del ADN en la caulogénesis adventicia y otras respuestas organogénicas que implican reprogramación celular, se evaluaron los niveles de 5-mC global y su distribución espacio temporal mediante inmunolocalización. El mayor grado de metilación se observó en los embriones zigóticos maduros en estado quiescente coincidiendo con resultados previos en órganos en dormición. En los procesos organogénicos, incluida la germinación como situación control, se observó una dinámica diferencial en patrones específicos de metilación o demetilación. En los embriones cultivados con auxinas y BA el patrón difiere del que siguen los embriones control a partir del sexto día de cultivo, ya que se produce un descenso debido, probablemente, a un desarrollo diferencial con cambios de expresión génica que acontecen durante la organogénesis adventicia. Los embriones cultivados en ABA también siguieron un patrón diferencial en relación con el control, con una demetilación posiblemente debida al desencadenamiento de una respuesta de estrés. El patrón de la histona H4 acetilada siguió una tendencia opuesta al de la metilación del ADN, confirmando el papel antagonista y la interconexión de estas marcas epigenéticas en la regulación génica. Como era de esperar, de acuerdo con su aspecto morfológico y a pesar de que las auxinas y el BA tenían un valor de metilación global similar, la distribución de ambas marcas epigenéticas en el tejido fue diferente. En los embriones cultivados en BA hay una metilación uniforme en todo el embrión que puede estar relacionada con una inhibición del crecimiento. Durante la caulogénesis la metilación disminuye, incrementándose paralelamente la acetilación de H4, especialmente en las nuevas yemas en formación, zonas de crecimiento muy activo. En los embriones cultivados con auxinas se observan cambios muy drásticos en las marcas epigenéticas de los meristemos radicular y caulinar, regiones muy sensibles a la señalización por reguladores del crecimiento. En el meristemo radicular de los embriones cultivados en ABA también se produce una demetilación a los tres días, debido probablemente al efecto de esta hormona provocando un retraso de la germinación. El análisis de expresión diferencial e identificación de genes candidatos implicados en la organogénesis adventicia, fue abordado mediante una hibridación supresora sustractiva y la hibridación de un dot blot con 191 genes seleccionados de un total de 426 secuencias identificadas. Mediante un análisis estadístico de los resultados se constató una inducción de las funciones relacionadas con el metabolismo, destacando el incremento en la expresión de algunos genes relacionados con estas funciones como: RuBIsCO, PRECURSOR PROTEICO DE TRANSPORTADOR NO ESPECÍFICO DE LÍPIDOS 1 (LTP1) y ¿-tubulina 1. Estos genes han sido identificados como diferenciales en respuesta a BA durante la fase de adquisición de competencia y fotomorfogénesis inducida por este regulador del crecimiento. Las citoquininas no sólo mejoran la fotosíntesis después de un periodo de estrés, sino que tienen también un papel importante en la transmisión de señal en mecanismos de defensa y senescencia asociados al estrés. Como consecuencia, varios genes relacionados con estrés como son: RELACIONADO CON PATOGÉNESIS 10 (PR-10), un gen perteneciente a la superfamilia de las proteina quinasas, PROTEÍNA 3 DE UNIÓN A Xa21 (XB3), QUINASA REGULADA POR CITOQUININAS 1 (CRK1), 25s ARNr y transposasa IS10-right, que muestran un incremento en su expresión en ABA, están reprimidos en BA de acuerdo con el papel en la mitigación del estrés que tienen las citoquininas. La metilación global y la identificación y el análisis de la función biológica de los genes relacionados con la organogénesis adventicia, nos condujeron a investigar la regulación epigenética mediante metilación en el ADN de genes candidatos, y el desenmascaramiento químico de otros posibles genes candidatos. Para ello se planteó un diseño experimental mediante el cual se pudieran identificar nuevos genes candidatos relacionados con procesos de desdiferenciación/rediferenciación de una forma fácil. Un desenmascaramiento químico mediante un tratamiento con 5-Aza-2-deoxicitidina en cultivos celulares indiferenciados fue considerada la mejor opción según los resultados previos obtenidos por otros grupos de investigación en Arabidopsis thaliana. La hibridación de un dot blot en esta situación y una inmunoprecipitación del ADN metilado nos proporcionaron unos resultados diferenciales en la inducción de 25S ARNr y RÁPIDA RESPUESTA A DESHIDRATACIÓN 15 (ERD15) frente al tratamiento con el agente demetilante. Ambas secuencias, relacionadas con estrés y con la transducción de señal hormonal frente a estímulos externos como funciones principales, resultan inducidas tras el tratamiento con la droga. La metilación no significativa de 25S rRNA, de acuerdo a los datos proporcionados por el MeDIP, puede ser relacionada con una inducción de su expresión ya que existencia de cientos de copias que pueden tener una regulación diferencial mediante metilación, por lo que pequeños cambios de metilación pueden implicar grandes cambios de expresión génica. El enriquecimiento diferencial de las secuencias metiladas obtenido a través de MeDIP nos permitió también identificar otras secuencias, como un transposon y varios genes relacionados con estrés como LTP-1, PR-10 y XB3. Estos resultados nos proporcionan la primera reseña de la metilación en estos genes asociados a estrés inducido por el cultivo in vitro y la aplicación de la droga demetilante, corroborando la relación directa entre las diferentes situaciones de estrés y una regulación mediante la metilación del ADN como respuesta a estrés. En los cultivos celulares utilizados como control se identificaron dos grupos principales de genes de acuerdo a su función biológica y un gen relacionado con desarrollo del meristemo y patrones de formación de órganos como es PROGRAMA DEL MERISTEMO ALTERADO 1 (AMP1) que regula la formación del embrión en Arabidopsis. El primero de los grupos está relacionado con estrés, y más concretamente con estrés en el retículo endoplasmático, cuya represión podría tener su significado con la inducción de ERD15 en el tratamiento con 5-Aza-2-deoxicitidina mitigando esta situación de estrés. El segundo grupo se compone de genes relacionados con fotosíntesis y transporte de electrones los cuales son reprimidos por 5-Aza-2-deoxicitidina probablemente debido a su posible acción en los genes nucleares del cloroplasto.