Rutas de transducción de señales y procesos de fosforilización implicados en la regulación de canales erg por TRH

Resumen

Los canales de K+ erg se expresan en distintos tipos celulares, habiéndoseles relacionado con el control del potencial de membrana basal, la excitabilidad celular, la secreción, la proliferación celular y la duración del potencial de acción cardíaco. En células adenohipofisarias la regulación de estos canales constituye un punto crucial de control de la actividad eléctrica que dirige la secreción de prolactina tras la activación del receptor de TRH. Aunque se sabe que este receptor está acoplado a proteínas G y se conocen otros pormenores, se desconocen aún varios de los componentes de la ruta de señalización que une el receptor de TRH con la modulación de la corriente erg. El trabajo recogido en esta tesis doctoral engloba dos partes, a veces solapantes: por un lado el estudio de posibles componentes específicos implicados en la cascada de señalización desde el receptor de TRH hasta los canales erg, y por otro lado el estudio de los cambios en fosforilación inducidos por la TRH a nivel del proteoma de las células, y más específicamente sobre la fosforilación de los propios canales erg. Los dos tipos de estudio se han desarrollado utilizando tanto células GH3 que expresan estos canales y el receptor de TRH de forma endógena, como células HEK-H36/T1 que expresan estos dos elementos de forma heteróloga. En ambos casos, la adición de la TRH a las células provoca una rápida modulación de carácter inhibitorio sobre las corrientes erg. En primer lugar, en cuanto a los componentes de la cascada de señalización de la TRH, hemos visto que su receptor se acopla a diferentes elementos de respuesta en función del tipo celular. Así, mientras que los dímeros ßy tienen un papel fundamental en la modulación de erg por TRH en células GH3, no parecen estar implicados en la ruta correspondiente en células HEK-H36/T1. Además, mediante técnicas de interferencia de RNA e inhibidores farmacológicos, hemos estudiado la implicación de diversas proteína quinasas en estas rutas de señalización. Así, hemos verificado que la presencia de la proteína Akt juega un papel fundamental en la correcta transmisión de la señal de TRH en células HEK-H36/T1, pero no en células GH3. También hemos mostrado que el bloqueo de la expresión de la quinasa PASK no produce un efecto apreciable en la modulación de erg por la TRH en ninguno de los dos tipos celulares. Por último, hemos demostrado que las quinasas ERK1/2 son necesarias para la correcta transmisión de la señal de la TRH en células GH3, aunque no están implicadas en la ruta correspondiente en las células HEK-H36/T1. En segundo lugar estudiamos los cambios en fosforilación observados tras la adición de TRH, utilizando técnicas de espectrometría de masas y fosfoproteómica cuantitativa. Mediante estos experimentos hemos logrado identificar múltiples proteínas cuyos estados de fosforilación varían tras el tratamiento con TRH, en concreto 261 en células HEK-H36/T1 y 98 en GH3, de las cuales 13 son comunes a los dos tipos celulares. Destacan entre ellas las quinasas ERK1 y ERK2, en las que hemos observado un marcado incremento en los niveles de fosforilación de los residuos responsables de su activación por la quinasa MEK1/2, y la proteína MARCKS, un sustrato de la PKC. También hemos estudiado la fosforilación de los canales erg, que sólo ha sido posible en las células HEK-H36/T1 por su baja expresión en las GH3. Así hemos encontrado 14 sitios de fosforilación de hERG, dos de los cuales (S250 y S261) no habían sido identificados previamente. El estado de fosforilación de otros dos de esos sitios (S239 y S1137) aumenta notablemente tras el tratamiento con TRH. A partir de estos sitios de fosforilación detectados en hERG hemos generado mutantes específicos sustituyendo los residuos fosforilables por alaninas. Por fin, se ha estudiado el efecto de estas mutaciones a nivel electrofisiológico, y se ha observado que la eliminación de cualquiera o todos esos sitios de fosforilación no presenta un efecto notable sobre las características electrofisiológicas del canal mutante, ni sobre los efectos de la TRH sobre el mismo.