Relevancia de la melatonina en la respuesta inmunológica de pacientes con lupus eritematoso sistémico

Resum

INTRODUCCIÓN: El lupus eritematoso sistémico (LES) es un desorden autoinmune multifactorial que se caracteriza por presentar anticuerpos anti-DNA de doble cadena (anti-dsDNA), una producción alterada de citoquinas pro-/anti-inflamatorias y una producción disminuida de células T reguladoras (Treg). Por otro lado, la melatonina ejerce un papel modulador sobre la morfología y funcionalidad de órganos del sistema inmunitario, así como sobre la producción de citoquinas. En este sentido, aunque la mayoría de los efectos inmunológicos de la melatonina parecen ser ¿protectores¿, la autoinmunidad es un campo en el cual no existe un consenso sobre el uso de esta sustancia. HIPÓTESIS: La melatonina producida por los linfocitos circulantes y/o exógenamente administrada, podría modular las alteraciones inmunológicas orquestadas por los diferentes tipos celulares de la inmunidad innata y adaptativa, vía regulación de citoquinas críticas en el LES. OBJETIVOS: i) Analizar los niveles de citoquinas pro- y anti-inflamatorias en el sobrenadante de cultivos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con LES. ii) Analizar el efecto inmunomodulador de la administración in vitro de melatonina sobre las PBMC de individuos sanos y pacientes con LES. iii) Cuantificar in vitro la proporción de células Treg y el efecto ejercido por la melatonina exógena en dicha población. iv) Cuantificar la producción de melatonina endógena en PBMC de pacientes con LES. MATERIAL Y MÉTODO: Para nuestro estudio realizamos cultivos in vitro de PBMC de 20 pacientes con LES y 20 controles sanos. La sangre fue extraída mediante tubos VACUTAINER® ¿ CPT. La cuantificación de citoquinas en sobrenadantes de cultivo, y el efecto de la administración de melatonina se realizó por una técnica que aúna la citometría de flujo y el ELISA. La producción de melatonina endógena en los cultivos de PBMC se determinó por ELISA. Los análisis de expresión génica se realizaron por RT-PCR a tiempo real. Por citometría de flujo se determinó el porcentaje de células Treg y el test MTT nos permitió analizar la viabilidad celular tras administrar melatonina exógena a los cultivos de PBMC. El análisis estadístico de datos se llevó a cabo con la ayuda del paquete de software estadístico SPSS v.15. RESULTADOS: La producción de IFN-¿, TNF-¿, IL-1ß, IL-9, IL-6, IL-2 e IL-10 está significativamente disminuida en las PBMC de pacientes con LES. Asimismo, la administración de melatonina exógena en estas PBMC no modifica la producción de citoquinas, a excepción de la IL-6, que es aumentada; mientras que en los cultivos de PBMC de controles sanos, la melatonina disminuye la producción de IFN-¿, TNF-¿, IL- 1ß, IL-9, IL-2 e IL-5. Por otro lado, los pacientes con LES presentan, de manera significativa, una mayor cantidad de células Treg que los controles, y la adición de melatonina aumenta el porcentaje de célula Treg, el ratio de células FOXP3+/FOXP3- y la producción media de FOXP3 en cada célula. Del mismo modo, la expresión de foxp3 es mayor en estos pacientes que en los individuos sanos y se correlaciona directamente con la expresión del gen hiomt. En cambio, la melatonina exógena no tiene ningún efecto en las células Treg de controles sanos. La expresión del factor de estimulación de células B (BAFF) fue mayor en los pacientes con LES, y la melatonina exógena fue capaz de reducir dicha expresión, observándose el efecto contrario en los individuos sanos. La producción de melatonina por PBMC fue mayor en los pacientes con LES, aunque la presencia de PHA no aumentó esta producción. En cambio, en la las PBMC de la población sana, la estimulación con PHA provocó un aumento en los niveles de melatonina. 2 CONCLUSIONES: i) Las PBMC de pacientes con LES bajo tratamiento con antipalúdicos, corticoides y/o inmunosupresores producen menos IFN-¿, TNF-¿, IL-9, IL-1ß, IL-6, IL-10 e IL-2, que las PBMC de individuos sanos, tras estimulación mitogénica. ii) La melatonina exógena ejerce un efecto dual en la respuesta Th, disminuyendo los niveles de IFN-¿, TNF-¿, IL-1ß, IL-9, IL-2 e IL-5 en los cultivos de PBMC de individuos sanos, y no modificando la producción de la mayoría de citoquinas en las PBMC de pacientes con LES, excepto de IL-6, que la aumenta. iii) Los pacientes presentan una mayor frecuencia de poblaciones Treg que los controles. iv) La administración de melatonina aumenta en los pacientes tanto la frecuencia de las células Treg como la producción media de FOXP3 por célula, así como el ratio CD4+FOXP3+/CD4+FOXP3-. v) La melatonina reduce la elevada expresión de BAFF en las PBMC de los pacientes con LES. Por el contrario, aumenta dicha expresión en las células de los controles. iv) Las PBMC de los pacientes con lupus producen mayores niveles de melatonina endógena que las de los individuos sanos, en condiciones basales. Por otro lado, la estimulación con PHA hace que las PBMC de los controles produzcan mayores niveles de melatonina que en condiciones basales.