Modulacion de la señalizacion celular por fosforilacion de STIM1Implicaciones fisiologicas

Resumen

INTRODUCCIÓN Y DESARROLLO TEÓRICO En las células eucariotas existen numerosas moléculas que actúan como segundo mensajero como AMPc, DAG o el calcio. Variaciones en las concentraciones del calcio libre intracelular están implicados en distintas funciones celulares como proliferación, muerte celular, contracción muscular, transmisión del impulso nervioso o expresión génica. La fuente principal de calcio es el medio extracelular y los reservorios intracelulares como es el caso del retículo endoplasmático (RE). Cuando se produce un vaciado de estos reservorios existe un mecanismo conocido como entrada de calcio operada por depósitos (SOCE). SOCE se define por primera vez en 1986 por Putney et al (Putney et al 1986), es un mecanismo que consiste en una serie de canales situados en la membrana plasmática denominados SOC y se activan por el vaciado de depósitos intracelulares, lo que permite la entrada de calcio al citoplasma y posteriormente la SERCA (bomba calcio ATPasa sita en la membrana del RE) rellena el lumen del RE. STIM1 es una proteína que aparece en la membrana del RE y actúa como sensor de calcio y regulador de SOCE, y por tanto, el mediador de eventos celulares en los que está implicado el calcio como segundo mensajero. La señalización celular se puede regular por multitud de modificaciones postraduccionales de las proteínas implicadas, entre estas modificaciones tenemos la fosforilación. En el año 2000 Manji et al definen a STIM1 como una proteína susceptible de ser fosforilada (Manji et al 2000), desde entonces muchos han sido los estudios enfocados a determinar los residuos implicados en el papel de STIM1 en la activación de SOCE, así como su implicación en otros eventos celulares. Uno de estos estudios realizados por Pozo-Guisado et al (Pozo-Guisado et al 2010) determinó mediante espectrometría de masas la fosforilación in vitro de los residuos de STIM1 Ser575, Ser608 y Ser621 en células HEK293. Además esta fosforilación se llevaba a cabo por las quinasas ERK1/2. Mediante anticuerpos fosfo-específicos en este trabajo se ha podido demostrar la fosforilación de STIM1 en las Ser575, Ser608 y Ser621 in vivo, sitios diana de las quinasas ERK1/2, cuando se produce el vaciado de depósitos intracelulares, no solamente con la utilización de tapsigargina (inhibidor de la SERCA y por tanto, compuesto que evita de modo irreversible el llenado del RE) sino también con la utilización de EGF, agente fisiológico activador de la ruta de señalización Ras-Raf-MEK-ERK, ruta implicada en multitud de funciones celulares como migración celular, expresión génica u otros como transición epitelio mesénquima. De tal modo que hemos podido confirmar como la activación de STIM1 por fosforilación en los residuos Ser575, Ser608 y Ser621, residuos fosforilados por las quinasas ERK1/2 regula algunos de estos procesos como es el caso de migración celular inducida por EGF y la transición epitelio-mesenquima mediada también por dicho factor de crecimiento, funciones a su vez implicadas activamente en el desarrollo de muchos tipos celulares de cáncer. Con la utilización de mutantes que expresan de modo estable, un STIM1 al que se ha sustituido las serinas diana de ERK1/2 (Ser575, Ser608 y Ser621) por alaninas lo que simula una defosforilación constitutiva, que veían disminuidos estos procesos fisiológicos (migración celular y transición epitelio-mesénquima inducidos por EGF). Tras la activación de STIM1, un proceso necesario para la activación de los canales SOCs es la translocación a la membrana de STIM1 donde puede interaccionar con dichos canales. Este proceso es dependiente de microtúbulos y para ello, es necesario la disociación de STIM1 de EB1, puesto que en células en estado de reposo, STIM1 se encuentra asociado a esta proteína que regula el crecimiento de los microtúbulos (Griegoriv et al 2008). En este trabajo se ha podido demostrar como la fosforilación de STIM1 modula también este proceso de disociación puesto que el mutante de STIM1-S575A-S608A-S621A, no se produce la disociación del complejo STIM1-EB1 tras el vaciado de depósitos tanto inducido por tapsigargina como por el factor de crecimiento EGF. Por todo ello, podemos concluir que la fosforilación de STIM1 en los sitios diana de ERK1/2 (Ser575, Ser608 y Ser621), se produce cuando se lleva a cabo el vaciado de los depósitos intracelulares y es necesario para la activación de SOCE. Además esta activación de SOCE no solamente con una droga drástica como es el inhibidor de la SERCA, tapsigargina, sino también con la utilización de un señalizador fisiológico como es el factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor implicado en multitud de procesos celulares como es el caso de migración celular y transición epitelio-mesenquima. Luego podemos considerar proponer la fosforilación de STIM1 como nueva diana terapéutica de tratamiento contra el cáncer. CONCLUSIONES 1.- El vaciado de los depósitos intracelulares de Ca2+ induce la fosforilación de STIM1 en los residuos Ser575, Ser608 y Ser621, siendo ERK1/2 las quinasas responsables de dicha fosforilación. 2.- La activación de STIM1 por fosforilación estimula la multimerización de STIM1, la disociación de EB1, la interacción con el canal ORAI1 y el influjo de Ca2+ desde el medio extracelular hacia el interior celular. 3.- La fosforilación de STIM1 en los residuos diana de ERK1/2 es detectada tanto con un tratamiento con tapsigargina, un inhibidor de la SERCA, como con el factor de crecimiento epidérmico EGF. 4.- La activación de la ruta Ras-Raf-MEK-ERK, ya sea mediante EGF, o con una versión constitutivamente activa de Ras (H-RasG12V), estimula la fosforilación de STIM1 en ausencia de Ca2+ extracelular, por lo que la fosforilación de STIM1 es independiente del influjo de Ca2+ desde el medio extracelular. 5.- La fosforilación de STIM1 en los sitios diana de ERK1/2 estimula la migración de células de adenocarcinoma endometrial inducida por EGF. Del mismo modo, la fosforilación de STIM1 regula la transición epitelio-mesénquima estimulada por EGF. 6.- El resveratrol inhibe el influjo de Ca2+ tras el vaciado de depósitos intracelulares inducido por tapsigargina en células HEK293. Además, esta inhibición es debida, al menos parcialmente, a la inhibición de la fosforilación de STIM1 en sitios diana de ERK1/2 mediada resveratrol. 7.- El resveratrol inhibe la multimerización de STIM1 estimulada por tapsigargina, así como la disociación de EB1 y la interacción con ORAI1. Estos resultados sugieren que el resveratrol, como inhibidor de SOCE, es un potencial inhibidor de migración celular y de la transición epitelio-mesénquima en células tumorales.