Control de la expresión génica de las histonas de Leishmania asociado al ciclo celular

Zusammenfassung

ABSTRACT .................................................................................. 1 ABREVIATURAS .......................................................................... 3 INTRODUCCIÓN.......................................................................... 5 1.- Leishmania. ................................................................................. 7 1.1.- Ciclo de vida ......................................................................................... 7 1.2.- La leishmaniosis.............................................................. 9 1.2.1.- La leishmaniosis en España......................................................................... 10 1.3.- Biología Molecular de Leishmania. ............................................................... 11 1.3.1.- El genoma................................................................... 11 1.3.2.- Expresión génica ......................................................................................... 13 1.3.3- Regulación de la expresión génica............................................................... 17 1.3.3.1.- Procesamiento de los ARNm. .................................................................. 17 1.3.3.2.- Estabilidad de mensajeros ........................................................................ 18 1.3.3.3.- Traducción de mensajeros........................................................................ 19 2.- El ciclo celular...................................................................................... 21 2.1.- Control del ciclo celular ................................................................................. 21 2.2.- Control de la expresión génica asociado a la fase S....................................... 23 3.- Las histonas.............................................................................. 26 3.1.- Control de la expresión génica de las histonas............................................... 27 3.2.- Las histonas de Leishmania ........................................................................... 29 3.2.1.- Organización génica de las histonas de Leishmania ................................... 31 3.2.2.- Expresión génica de las histonas de Leishmania ........................................ 32 OBJETIVOS.............................................................................. 35 MATERIALES Y MÉTODOS....................................................................................... 39 1.- Cultivo de parásitos.................................................................................... 41 2.- Tratamientos con Hidroxiurea y Actinomicina D. ............................................ 41 3.- Transfección de promastigotes.......................................................................... 41 4.- Construcciones plasmídicas. ............................................................................. 42 5.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)..................................................... 46 6.- Mapeo de ARNm por RT-PCR. ........................................................................ 47 7.- Secuenciación de ADN. .................................................................................... 47 8.- Preparación de células competentes y transformación...................................... 47 9.- Aislamiento de ADN de plásmidos................................................................... 48 10.- Aislamiento de ARN de Leishmania............................................................... 48 11.- Análisis de la distribución de ARNm en polisomas por gradientes de sacarosa. ......................................................................... 48 12.- Electroforesis de ARN y transferencia a membrana. ...................................... 48 13.- Marcaje radiactivo de ADN de cadena doble. ................................................ 49 14.- Marcaje radiactivo de Oligodesoxirribonucleótidos. ...................................... 50 15.- Hibridación de filtros. ..................................................................................... 50 16.- Marcaje de proteínas de nueva síntesis. .......................................................... 51 17.- Aislamiento de núcleos. .................................................................................. 51 18.- Inmunoprecipitaciones. ........................................................... 51 19.- Electroforesis de proteínas. ............................................................................. 53 20.- Ensayos de Western blot. ................................................................................ 53 21.- Citometría de flujo y análisis del ciclo celular................................................ 54 23.- Análisis de las bases de datos.......................................................................... 55 RESULTADOS ....................................................................... 57 1.- Análisis de la expresión del gen H2A4 mantenido de forma episómica. .......... 59 2.- Estudio de la implicación de la región codificante y de las diferentes regiones no traducidas en el control traduccional de los genes de histonas de L. infantum................................................................................. 64 3.- Estudio del papel de las regiones 5"UTR y 3"UTR en el control por ciclo celular de la histona H2A de L infantum.......................................................... 68 4.- Análisis de la presencia de los elementos HRE y CCRE en histonas y otros genes de expresión asociada a la fase S en L. infantum. .................................. 70 5.- Efecto de la delección del elemento HRE del gen H2A4 de L. infantum.......... 72 6.- Análisis del efecto de las delecciones parciales de HRE en la expresión asociada al ciclo celular del gen 6xhisH2A. ..................................................... 75 7.- Análisis de la implicación de CCRE y HRE en la estabilidad del ARNm........ 80 8.- Búsqueda del elemento HRE en genes de histonas de otros tripanosomátidos. ................................................................... 82 9.- Análisis del comportamiento traduccional de otros genes de expresión asociada al ciclo celular.................................................................................... 84 DISCUSIÓN.............................................................................. 85 1.- La expresión del gen H2A mantenido como episoma mantiene el control de la expresión génica asociada al ciclo celular............................................... 87 2.- Implicación de las diferentes regiones génicas en el control de las histonas asociado al ciclo celular. .................................................................................. 91 3.- HRE es esencial para la represión traduccional y la acumulación de los tránscritos fuera de la fase S............................................................................. 94 4.- Modelo de acción de HRE y CCRE en la región 3"UTR de las histonas. ........ 99 CONCLUSIONES............................................................................ 101 BIBLIOGRAFÍA........................................................................ 105