Reprogramación del polen a embriogénesis inducida por estrésidentidad celular, muerte celular programada y papel de la metilación de DNA

Zusammenfassung

El desarrollo del grano de polen es un proceso estrictamente regulado a nivel génico que conduce a la formación de un organismo haploide, el gametofito masculino o grano de polen, cuyas células poseen una alta especialización, necesaria para su importante función en la germinación del tubo polínico y doble fecundación de las plantas con flores. Mediante la aplicación de un tratamiento de estrés in vitro en la etapa adecuada del desarrollo, concretamente en la fase de microspora vacuolada, la microspora puede desviar su ruta de desarrollo gametofítico hacia una ruta embriogénica con la formación de un embrión haploide, proceso conocido como embriogénesis del polen, que representa una importante herramienta biotecnológica en mejora vegetal para la obtención rápida de plantas doble haploides, líneas isogénicas y nuevas variedades. Este proceso se ha puesto a punto en numerosas especies, sin embargo, su rendimiento es muy bajo en algunas plantas de interés económico, ya que todavía son poco conocidos los mecanismos celulares y moleculares que intervienen en el cambio de programa de desarrollo. El desarrollo esporofítico y gametofítico del polen en la antera está asociado al correcto desarrollo del tapetum o tejido nutricio de la antera, que una vez finalizada su función sufre una degeneración mediante muerte celular programada (MCP). En esta Tesis se plantea el estudio de diferentes aspectos de la fisiología del proceso de embriogénesis del polen en comparación con el desarrollo gametofítico del polen, con el objetivo de comprender los mecanismos que controlan la reprogramación celular, la adquisición de competencia embriogénica y la identidad celular mediante tratamientos de estrés, centrándose el estudio en la identificación de marcadores de embriogénesis, la dinámica de la pared celular, la metilación del DNA y los sucesos de muerte celular programada (MCP). Por otro lado, debido a la importancia de la MCP y la metilación del DNA durante la reprogramación a embriogénesis inducida por estrés, se plantea también el estudio de la dinámica de estos dos procesos durante la diferenciación del polen in vivo, especialmente, durante el desarrollo y MCP del tapetum. Resumen El material empleado para este estudio han sido diferentes sistemas vegetales, en función de los objetivos perseguidos en cada caso. Así, por un lado, se han utilizado especies herbáceas, modelos del proceso, en las cuales se han establecido eficientes sistemas de cultivo in vitro como Brassica napus y Nicotiana tabacum, y por otro lado, un árbol frutal, Olea europaea, con un mayor interés aplicado, en el que los sistemas de cultivo in vitro, están todavía en desarrollo. La comparación entre especies modelo y árboles, puede ser muy útil en el desarrollo y mejora de nuevos sistemas in vitro, por extensión de conocimientos entre especies. El abordaje experimental ha consistido en el desarrollo de cultivos in vitro de microsporas aisladas y el empleo de diversas técnicas: a)citoquímicas para la detección in situ de diferentes componentes celulares (Calcofluor White para celulosa, I2KI para almidón y Azul de Evans para detección de muerte celular), b)inmunocitoquímicas con anticuerpos específicos que reconocen pectinas con diferente grado de esterificación (Jim7 y Jim), RNA total (anti-RNA), citosinas metiladas (anti-5mdC) y MCP (caspasa 3), c)ensayos inmunoquímicos de “Dot blot” y ”Western blot”, d)ensayos de actividad enzimática, e)estudios de expresión mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) y PCR semicuantitativa, f)electroforesis capilar de alta resolución (HPCE) para cuantificar el grado de metilación global del DNA y g)herramientas de transformación transitoria con GFP. Para ello, se emplearon diferentes métodos de procesamiento de muestras, los cuales fueron adaptados para el material objeto de estudio en cada momento. Después del tratamiento de estrés inductor de la embriogénesis, las microsporas que reprograman su ruta abandonan su programa de desarrollo y adquieren competencia embriogénica, sin embargo, aquellas otras que no son capaces de reprogramarse hacia embriogénesis, se paran y mueren. En esta Tesis, se ha optimizado el sistema de cultivo in vitro de microsporas aisladas de Brassica napus para una mayor eficiencia de inducción a embriogénesis mediante estrés a 32ºC, junto con el desarrollo de una metodología óptima para la germinación de embriones y su conversión a plantas Resumen adultas. Al mismo tiempo, se ha desarrollado un nuevo sistema de cultivo in vitro en Brassica napus para la inducción eficiente de la embriogénesis a 18ºC, sistema en el que la microspora sigue dos rutas de desarrollo embriogénico diferentes y permitirá abordar el desarrollo de estudios comparativos entre ellas. Se han estudiado otras posibles respuestas al tratamiento de estrés inductor de las microsporas que no reprograman su ruta de desarrollo hacia embriogénesis, mediante el análisis de los niveles de muerte celular y marcadores de MCP durante las primeras etapas del cultivo embriogénico, identificándose por primera vez la localización y actividad enzimática tipo caspasa. Los resultados muestran que las primeras etapas del cultivo se caracterizan por elevados niveles de muerte celular e indican que algunas de las células que no responden al tratamiento de estrés inductor de embriogénesis, siguen una ruta dependiente de “actividad caspasa 3 like”, sugiriendo que parte de los elevados niveles de muerte celular detectados en las primeras etapas del cultivo, podrían deberse a procesos de muerte celular programada (MCP), posiblemente desencadenados por el tratamiento de estrés. La identificación de rutas de muerte celular programada como respuesta al tratamiento de estrés en cultivos de polen, serán de gran ayuda en el diseño de estrategias in vitro que puedan bloquear la MCP y que aumenten la viabilidad y la inducción de embriogénesis. Se han establecido marcadores moleculares y celulares que cambian con la identidad celular y diferencian las células reprogramadas a embriogénesis en las primeras etapas del proceso, como son: la organización estructural idéntica de los núcleos, la tabicación citoplásmica, la ausencia de almidón y la diferente composición de pectinas y celulosa de la pared celular. Los marcadores identificados son comunes para olivo y colza, sugiriendo que los mecanismos implicados en la reprogramación a embriogénesis son análogos en ambas especies pudiendo ser empleados como herramientas para la monitorización de procesos metabólicos implicados en la reprogramación y para la identificación de Resumen células destinadas al programa de desarrollo embriogénico frente a aquellas otras células que no responden al tratamiento inductor. Las pectinas son un componente principal de las paredes celulares, su modificación por la enzima pectinmetilesterasa (PME) actúa regulando la estructura y la rigidez de la pared celular. En este trabajo, se ha analizado la dinámica de la esterificación de pectinas y el patrón de expresión de la BnPME durante los dos programas de desarrollo del polen, el desarrollo gametofítico y la embriogénesis de polen inducida mediante tratamientos de estrés. Los resultados obtenidos indican que las pectinas esterificadas y no esterificadas tienen patrones de distribución opuestos durante los dos programas de desarrollo, en relación a los procesos de proliferación y diferenciación. Así, el polen maduro y las etapas más avanzadas del desarrollo embriogénico, con una mayor diferenciación celular, se caracterizan por elevados niveles de pectinas desmetilesterificadas, así como de una alta expresión de BnPME; mientras que las microsporas inmaduras y las primeras fases de embriogénesis, asociadas con procesos de proliferación, presentan una mayor proporción de pectinas altamente esterificadas y una expresión baja de BnPME. En base a estos resultados, los altos niveles de pectinas no esterificadas pueden ser considerados como marcadores del desarrollo gametofítico, mientras que la presencia de pectinas esterificadas pueden emplearse como un marcador del desarrollo embriogénico del polen, permitiendo la identificación de las microsporas inducidas y los primeros proembriones. El análisis de localización in vivo de la proteína de fusión GFP-PME en el microscopio confocal en hojas de tabaco transformadas transitoriamente, indica que la proteína PME es dirigida a las paredes celulares diferenciadas de las células epidérmicas y del mesófilo, donde presumiblemente realiza su actividad enzimática sobre las pectinas in muro. Resumen Los mecanismos que subyacen a la reprogramación nuclear, implican cambios en la estructura de la cromatina y la expresión génica de todo el genoma. Los cambios epigenéticos o modificaciones covalentes de los constituyentes de la cromatina, como la metilación del DNA, modulan la conformación de la cromatina y por tanto son un factor clave de regulación de estos cambios y como consecuencia, de la actividad génica. En este trabajo se ha analizado los niveles y dinámica de metilación del DNA durante el desarrollo y embriogénesis del polen. Se ha puesto a punto el ensayo para cuantificar el nivel de metilación de DNA genómico mediante electroforesis capilar de alta resolución (HPCE) en anteras y microsporas aisladas en diversas etapas del desarrollo gametofítico del polen y del cultivo embriogénico. Los resultados indican cambios en la metilación del DNA y en la arquitectura nuclear durante la diferenciación, proliferación y MCP. Así, durante el proceso de maduración del polen y MCP del tapetum, se produce un aumento del nivel de metilación, asociado a la heterocromatinización que tiene lugar durante estos procesos. Sin embargo, tras la reprogramación a embriogénesis de las microsporas, los niveles de metilación disminuyen, en relación al proceso de proliferación que se inicia como consecuencia del cambio de programa de desarrollo. En etapas posteriores del proceso de embriogénesis, se aprecia un incremento en los niveles de metilación de DNA, asociado a la diferenciación que tiene lugar en las etapas avanzadas del desarrollo embriogénico. Además, los resultados obtenidos muestran cambios específicos en los patrones de distribución nuclear de la 5-metildeoxicitidina (5mdC), durante los programas de desarrollo estudiados, en relación a los patrones de condensación cromatínica. En este trabajo también se ha analizado la expresión del gen de la enzima DNA metiltransferasa 1, NtMET1, principal responsable de la metilación del DNA, en etapas específicas de los cultivos embriogénicos, del desarrollo del polen y de la MCP del tapetum. Los resultados muestran que la expresión de NtMET-1 está regulada durante el desarrollo gametofítico y la embriogénesis del polen; los cambios de nivel Resumen de expresión están asociados a las variaciones de metilación global del DNA que suceden con el cambio de programa de desarrollo y a procesos de diferenciación y proliferación, aumentando su expresión en fases de alto grado de metilación y disminuyendo cuando la metilación global del DNA es baja. Durante la microsporogénesis y desarrollo in vivo del polen, el tapetum, tejido nutricio de la antera, tiene una función fundamental y una vez terminada inicia un proceso de degradación mediante MCP. En este trabajo, se han analizado los cambios en núcleo y citoplasma para la caracterización de la MCP y la identificación de marcadores de apoptosis en el tapetum. Los resultados muestran por primera vez, la localización y determinación de actividad enzimática de proteínas tipo caspasa 3 en el tapetum, indicando que las células del tapetum sufren un proceso de MCP a través de una ruta dependiente de proteínas tipo caspasa 3. El proceso se caracteriza por una progresiva condensación cromatínica, lobulación nuclear, contracción citoplásmica y cambios en la distribución de RNA y segregación de ribonucleoproteínas (RNPs), características propias de los procesos de apoptosis de células animales. También se ha analizado la metilación del DNA durante el desarrollo y MCP del tapetum, observándose un incremento de los niveles de metilación global del DNA y un cambio en el patrón de distribución de 5mdC, desde pequeños spots en etapas metabólicamente activas hasta su concentración en grandes masas de cromatina condensada en MCP avanzada. El análisis de expresión de NtMET1 indica un incremento de la expresión durante el desarrollo y MCP del tapetum. En este trabajo se han estudiado los niveles y distribución de marcadores nucleares específicos implicados en la síntesis, procesamiento y degradación de RNA durante la diferenciación in vivo del polen y MCP del tapetum. Se ha analizado la distribución de híbridos DNA:RNA, CstF (“cleavage stimulation factor”), RNAs poliadenilados y RNasa A. Los resultados obtenidos, muestran que durante la diferenciación del polen in vivo tiene lugar una remodelación del dominio Resumen intercromatínico que conlleva una disminución gradual de la actividad transcripcional. El incremento de los niveles de metilación detectados en estos procesos aparecen asociados a esta disminución de la actividad transcripcional. Durante el desarrollo y MCP del tapetum, nuestros resultados aportan nuevos datos sobre la organización estructural y funcional del núcleo. La disminución de híbridos DNA:RNA, transcritos poliadenilados y de los factores de splicing como CstF en comparación con células transcripcionalmente activas, indican una disminución de la actividad transcripcional asociado al proceso de MCP, al mismo tiempo que sugieren la participación de la enzima RNasa A en la degradación de RNA en etapas tempranas de la MCP del tapetum apoyando la idea de que durante el desarrollo y MCP del tapetum se produce una disminución de la síntesis y procesamiento de RNAm, acompañado de un proceso de degradación masiva de RNA. Los resultados obtenidos en esta Memoria Doctoral aportan una información clave sobre la fisiología de la reprogramación celular y la adquisición de competencia embriogénica, procesos de gran interés básico y que además podrán ser empleados en el diseño y optimización de nuevos sistemas in vitro con mayor eficiencia, además de establecer las bases para el diseño de estrategias de transformación.