Epidemiología molecular y bases genéticas de la resistencia y virulencia de Staphylococcus aureus de diferente origen

Resum

Staphylococcus aureus es una bacteria comensal y patógena, que se encuentra en el ser humano y en animales tanto en estado portador como causando enfermedad. Su estructura poblacional es altamente clonal, lo que está facilitado por la presencia de sistemas de restricción-modificación (RM) que modulan el intercambio genético. A pesar de ello, existen fenómenos de transferencia horizontal que permiten la dispersión o intercambio de elementos genéticos móviles (EGM) y sistemas reguladores entre clones del mismo linaje e incluso de diferentes linajes. La presente Tesis Doctoral analiza la estructura poblacional de una amplia colección de aislamientos de S. aureus de diverso origen (humano, alimentos y animales) y examina la distribución de determinantes de resistencia y virulencia entre los linajes encontrados. Los aislamientos analizados proceden de pacientes de dos hospitales, de portadores sanos, de muestras de alimentos y de manipuladores de alimentos, todos ellos del Principado de Asturias (PA). También se incluyeron en el estudio aislamientos de origen animal de Alemania, pertenecientes al clon emergente ST398/CC398. Los aspectos desarrollados fueron los siguientes: 1. Identificación de los linajes circulantes en el PA y de su variabilidad interna mediante el uso de distintas técnicas de tipificación: electroforesis en campo pulsante (PFGE), secuenciación de múltiples loci (MLST), secuenciación del gen de la proteína A (spa) y amplificación de los genes sau1hsdS1 y sau1hsdS2 del sistema RM Sau1. Se estableció la presencia de 15 linajes en la región (CC1, CC5, CC8, CC9, CC12, CC15, CC22, CC25, CC30, CC45, CC59, CC72, CC88, CC97, CC121) siendo mayoritarios CC5, CC30 y CC45. Además, se desarrolló un protocolo para la tipificación por PFGE del clon emergente ST398 no tipificable anteriormente con esta técnica. 2. Detección de determinantes de virulencia y de EGM implicados en su dispersión. A diferencia del clon ST398, los aislamientos del PA presentaron un número muy elevado de determinantes de virulencia asociados a EMG (islas genómicas, islas de patogenicidad, profagos, y plásmidos), combinados en numerosos perfiles. Estos resultados ponen de manifiesto la elevada plasticidad del genoma de S. aureus, lo cual facilita su adaptación a los distintos nichos ecológicos que ocupa. Este apartado se completó con la caracterización molecular de un plásmido hibrido de virulencia-resistencia, que representa un interesante ejemplo de ingeniería evolutiva. 3. Estudios de resistencia. Se encontraron elevados porcentajes de resistencia, especialmente frente a ß-lactámicos, aminoglicosidos, macrólidos y lincosamidas, y de multirresistencia, en aislamientos clínicos del PA y en CC398, con respecto a los aislamientos recogidos en la comunidad. Se identificaron los genes responsables de las resistencias y los EGM implicados en su dispersión (transposones y plásmidos), y se estableció su distribución en los diferentes linajes. La determinación de los tipos SCCmec en aislamientos resistentes a meticilina permitió identificar los clones MRSA circulantes en la región y dentro del CC398. La Tesis Doctoral amplia el conocimiento sobre la estructura poblacional de S. aureus, y sobre las propiedades de resistencia y virulencia de los linajes y clones detectados. Además, identificó los clones epidémicos, esporádicos y emergentes que han estado circulando en el PA, cuyo seguimiento epidemiológico debe continuar en el futuro. Staphylococcus aureus is both a commensal and a pathogenic bacterium, able to cause disease or to establish a carrier state in humans and animals. S. aureus has a highly clonal population structure, which is facilitated by the presence of restriction-modification (RM) systems that modulate the genetic exchange. However, horizontal transfer events can occur allowing the spread or exchange of mobile genetic elements (MGE) and regulatory systems between clones of the same and even different lineages. This Doctoral Thesis analyzes the population structure of a large collection of isolates of S. aureus from different origins (human, animal and food), and examines the distribution of resistance and virulence determinants among different lineages. The isolates analyzed were recovered from human clinical samples in two hospitals, healthy carriers, food samples and food handlers in the Principality of Asturias (PA). Isolates collected in Germany from animal samples and belonging mainly to the emerging ST398/CC398 clone were also analyzed. The main objectives of the Thesis were the following: 1. Identification of the clones and lineages which have been circulating in the PA, both in nosocomial and community settings, and its internal variability using different typing techniques: pulsed field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST), protein A gene (spa) typing, and PCR amplification of the sau1hsdS1 and sau1hsdS2 of the Sau1 RM system. By these means, 15 lineages (CC1, CC5, CC8, CC9, CC12, CC15, CC22, CC25, CC30, CC45, CC59, CC72, CC88, CC97, CC121) were detected in our region, with CC5, CC30 and CC45 being predominant. Moreover, we developed a new typing PFGE protocol for CC398, which was previously untypeable by this technique. 2. Detection of virulence determinants and MGEs involved in their spread. In contrast to CC398, the isolates from the PA carried a large number of virulence genes, associated with MGEs, such as genomic islands, pathogenicity islands, prophages and plasmids, and arranged in many different combinations. These results reveal the high plasticity of the S. aureus genome, which can be viewed as a means of adaptation to the different ecological niches that can be colonized by this bacterium. These studies were complemented with the characterization of a hybrid virulence-resistance plasmid, which represents an interesting example of evolutionary engineering in S. aureus. 3. Resistance studies. High rates of resistance, particularly against ß-lactams, aminoglycosides, macrolides and lincosamides, as well as multidrug resistance, were found in clinical isolates recovered in the PA and the CC398 clone, in comparison to isolates recovered in the community. The genes responsible for the resistances detected, and the MGEs involved in their spread (transposons and plasmids), were identified and their distribution among different lineages and clones was established. Determination of the SCCmec types in methicillin-resistant isolates led to the identification of the MRSA clones circulating in the PA and within CC398. This Doctoral Thesis increases the existing knowledge on the population structure of S. aureus, and on its resistance and virulence properties. It supplies information on the epidemic, sporadic and emerging clones which have been circulating in the PA, and highlights the importance of further epidemiological surveillance.