Limonoato deshidrogenasa de microorganismos. Purificación, caracterización y clonación

Résumé

Se ha purificado hasta homogeneidad la limonoato deshidrogenasa (Ldasa) de R. Fascians, organismo que expresa dicha enzima de forma constitutiva, a diferencia de las restantes especies bacterianas en las que esta ha sido detectada. La enzima pura ha sido caracterizada físico-química y cineticamente y se han obtenido anticuerpos específicos frente a ella en conejo. Sehan estudiado las variaciones de actividad Ldasa en cultivos de Rhodoc ccus en presencia de distintas fuentes de carbono, con especial énfasis en la inducción de la actividad LDasa por limonoato. Las preparaciones de enzima pura han permitido la secuenciación de su extremo amino terminal. El conocimiento de esta secuencia de aminoácidos ha hecho posible, mediante la técnica de PCR inversa, la obtención de una sonda específica para el gen de la LDasa. Esta sonda se ha utilizado para rastrear los clones de la genoteca de R. Fascians que hemos construido en cosmidos. A partir de uno de los clones que ha dado señal positiva, se ha secuenciado un fragmento de 6 kb en el que parece encontrarse la secuencia de nucleotidos correspondiente al extremo amino de la proteina.