Análisis de la respuesta al plegamiento incorrecto de proteínas en "Aspergillus awamori"caracterización del gen "hac"A y del promotor del gen "bip"A

Abstract

Desde hace décadas los hongos filamentosos han sido considerados como excelentes productores de proteínas, sin embargo a pesar de la aplicación de diferentes técnicas de Biología Molecular los niveles de secreción de proteínas heterólogas registrados aún siguen siendo bastante limitados, evidenciando la formación de diversos cuellos de botella a lo largo de la ruta secretora. Estudios llevados a cabo sobre la respuesta a la formación de proteínas mal plegadas (UPR) en diversos organismos eucariotas han determinado que este mecanismo responde a una modulación muy precisa dirigida a favorecer la secreción de proteínas. La caracterización de la UPR en hongos filamentosos puede resultar una herramienta muy útil para optimizar la producción de proteínas heterólogas Por este motivo se ha llevado a cabo la clonación y caracterización del gen hacA en Aspergillus awamori ya que el factor de transcripción HACA regula la expresión de numerosos genes participantes de la ruta secretora. Se ha estudiado el efecto de la sobreexpresión del gen hacA en una cepa productora de la proteína heteróloga taumatina evidenciando una relación directa entre los niveles de expresión del gen hacA con los niveles de expresión de genes que codifican proteínas chaperonas (bipA) y foldasas (pdiA) lo que se traduce en un incremento de taumatina secretada. Por el contrario la sobreexpresión de hacA provoca un descenso de los niveles de secreción de la proteína endógena glucoamilasa. La atenuación de la expresión del gen hacA pone de manifiesto la existencia de rutas alternativas de regulación transcripcional de los genes bipA y pdiA. Se ha observado que la intensidad de la respuesta UPR obedece al grado de estrés que está sufriendo la cepa fúngica. Asimismo se ha comprobado que la adición de DTT ejerce un efecto negativo sobre la producción de la proteína taumatina a pesar de los elevados niveles de transcrito alcanzados por los genes bipA y pdiA, por el contrario, el aumento de la expresión de ambos genes debidos a estrés por choque térmico permite mantener e incluso optimizar la producción de la proteína heteróloga. Se ha llevado a cabo el desarrollo de un sistema de integración dirigida y monocopia en el locus pyrG de una cepa auxótrofa de uridina obtenida mediante radiación ultravioleta en una cepa de A. awamori para poder realizar estudios comparativos sobre la funcionalidad del promotor bipA. Se han secuenciado 1000 pb de bases del promotor bipA de A. awamori donde se han localizado posibles secuencias de unión al factor de transcripción HACA y se ha comprobado la funcionalidad de las mismas incluso en condiciones normales de crecimiento.